李笑軒， 李利軍*， 何雨涵， 程 昊， 馮 軍

(1.廣西糖資源綠色加工重點實驗室,廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,廣西柳州 545006；2.蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,廣西南寧 530004)

諾氟沙星(Norfloxacin,NOFX)屬于喹諾酮類抗生素藥物，由于其具有良好的抗菌性能和廣泛的抗菌譜，被大量應(yīng)用于臨床治療、畜牧養(yǎng)殖和園藝等領(lǐng)域[1 - 3]。然而，抗生素藥物的濫用已經(jīng)嚴(yán)重威脅到環(huán)境和人類健康[4]。到目前為止，雖然有多種抗生素的檢測方法，如毛細(xì)管氣相法[5]、間接熒光免疫分析法[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7]等。但這些方法大多存在步驟繁瑣、耗時長等缺點，因此，研究抗生素高效、快速及準(zhǔn)確的檢測方法具有重要意義。

分子印跡聚合物(MIPs)由于其可以在復(fù)雜樣品中特異性識別目標(biāo)分子而受到廣泛關(guān)注，但該技術(shù)存在難以富集、不易分離等缺點[8,9]。將磁性基底與分子印跡技術(shù)相結(jié)合，使得聚合物不僅具有良好的富集效果，還避免了繁瑣的離心、抽濾等步驟[10]。氧化石墨烯(GO)具有極大的比表面積，并且表面存在大量可以與金屬相連的官能團[11]，因此采用Fe3O4/GO/Ag作為基底材料，可以很好地與分子印跡及SERS技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)目標(biāo)藥品的快速、準(zhǔn)確、痕量及無免疫檢測。除此之外，鹽酸多巴胺可以在弱堿條件下發(fā)生自聚合，無需加熱及引發(fā)劑[12]，因此采用多巴胺聚合法，可以使磁性分子印跡聚合物的制備更為簡單。

本文采用將磁性基底與分子印跡及SERS技術(shù)相結(jié)合的方法，制備了一種新型磁性分子印跡聚合物Fe3O4/GO/Ag-MIPs，使其成為兼具光、磁及選擇特性的復(fù)合功能材料。研究發(fā)現(xiàn)該聚合物應(yīng)用于諾氟沙星的檢測，具有優(yōu)異的選擇識別能力、良好的重復(fù)性及SERS性能，并可以應(yīng)用于實際藥品。方法對實現(xiàn)復(fù)雜樣品中目標(biāo)分子的特異性檢測具有良好的應(yīng)用價值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

XploRAPLUS型激光共聚焦拉曼光譜儀(法國，Horiba公司)；JEOL JEM 2100型透射電子顯微鏡(日本，電子株式會社)；Hitachi S-4800型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本，日立公司)；Bruker D8A A25型X射線衍射儀(德國，布魯克公司)。

FeCl3·6H2O(分析純，中國科密歐化學(xué)試劑有限公司)，乙二醇(分析純，中國化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心)，氧化石墨烯(GO，中國中科時代納米有限公司)，SnCl2·2H2O(分析純，中國光華科技股份有限公司)，聚乙二醇(PEG4000)、NaAc，甲醛、氨水(分析純，中國西隴化工股份有限公司)，甲醇、無水乙醇(分析純，中國科隆化學(xué)品有限公司)，AgNO3、聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP)(分析純，中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸多巴胺(DA)(分析純，中國上海柏卡化學(xué)有限公司)，三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、諾氟沙星(NOFX)(分析純，中國阿拉丁試劑有限公司)。實驗用水為去離子水。

1.2 材料的制備

1.2.1 Fe3O4/GO的制備參照文獻方法[13]并進行優(yōu)化：將0.2 g GO超聲分散于45 mL乙二醇中，將1.35 g FeCl3·6H2O、1.0 g PEG4000和2.7 g NaAc依次加入上述溶液中，50 ℃條件下攪拌4 h后，將混合物轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，在200 ℃條件下反應(yīng)8 h，然后冷卻至室溫，用去離子水和乙醇洗滌2～3次，真空烘干后，待用。

1.2.2 Fe3O4/GO/Ag的制備參考文獻報道[14]：將0.1 g制備好的Fe3O4/GO超聲分散于10 mL去離子水中，向其中加入10 mL 3%的SnCl2·2H2O溶液，反應(yīng)10 min后，用去離子水和乙醇清洗2～3次并分散于一定量的去離子水中。隨后，在超聲條件下加入10 mL銀氨溶液(25 mmol/L)，超聲反應(yīng)30 min后，用去離子水和乙醇清洗2～3次，得到Fe3O4/GO/Ag晶種。用磁鐵收集制備好的Fe3O4/GO/Ag晶種，將其分散于200 mL含0.2% PVP的AgNO3(20 mmol/L)溶液中，在25 ℃、超聲條件下加入過量的氨水(28%)和甲醛(37%)溶液，反應(yīng)幾秒鐘后即得到Fe3O4/GO/Ag粒子，最后用磁鐵分離產(chǎn)物并用去離子水和乙醇清洗2～3次，真空烘干后，待用。

1.2.3 Fe3O4/GO/Ag -MIPs的制備參考文獻方法[15]并進行優(yōu)化：稱取0.02 g Fe3O4/GO/Ag粒子與0.01 g DA，超聲分散于20 mL的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.5)中，攪拌均勻后向其中加入0.006 g模板分子(NOFX)，持續(xù)攪拌一定時間后，通過磁場分離產(chǎn)物，用甲醇-乙酸(9∶1,V/V)溶液對模板分子進行洗脫，最終得到聚合物Fe3O4/GO/Ag-MIPs。非印跡聚合物(NIPs)的制備過程除不加模板分子NOFX外，其它條件與分子印跡聚合物相同。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與拉曼光譜采集

常溫下配制1.0×10-3mol/L NOFX標(biāo)準(zhǔn)溶液，并稀釋至所需濃度，常溫儲存待用。取100 μL不同濃度的待測標(biāo)準(zhǔn)溶液與400 μL Fe3O4/GO/Ag-MIPs粒子混合，超聲10～20 min后，滴加在外加磁場的石英玻璃片上，晾干后采集拉曼光譜。拉曼光譜采集參數(shù)：波長為638 nm，積分時間為10 s，積分次數(shù)為1次，功率為37.5 mW。磁性分子印跡聚合物制備過程及SERS檢測示意圖如圖1所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件優(yōu)化

分別向乙二醇中加入不同質(zhì)量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g)的氧化石墨烯，如圖2a所示，氧化石墨烯的質(zhì)量控制在0.2 g時，拉曼信號最強，其用量過大時拉曼信號反而降低，因此0.2 g被認(rèn)為是氧化石墨烯的最佳質(zhì)量并用于進一步實驗。

功能單體(DA)及模板分子(NOFX)的用量在制備分子印跡聚合物時起著至關(guān)重要的作用[16]。為了考察鹽酸多巴胺和諾氟沙星的用量對MIPs的影響，保持模板分子諾氟沙星量不變，采用不同質(zhì)量(0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 g)的鹽酸多巴胺制備出分子印跡聚合物，如圖2b所示，鹽酸多巴胺的質(zhì)量在0.01 g時，拉曼信號最強，之后隨著鹽酸多巴胺質(zhì)量的增加，拉曼信號反而降低，因此認(rèn)為0.01 g是鹽酸多巴胺的最佳質(zhì)量；保持功能單體鹽酸多巴胺的量不變，采用不同的質(zhì)量(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g)的諾氟沙星制備出MIPs，如圖2c所示，隨著諾氟沙星質(zhì)量的增加，拉曼信號逐漸增強，但諾氟沙星質(zhì)量達到0.06 g后，拉曼信號增加程度趨于平緩。綜合考慮，0.06 g被認(rèn)為是諾氟沙星的最佳質(zhì)量并用于進一步實驗。

圖2 諾氟沙星標(biāo)記的分子印跡聚合物在1 420 cm-1處的SERS強度。(a)GO用量；(b)DA用量；(c)NOFX用量；(d)聚合時間；(e)模板分子(NOFX)在不同洗脫時間的拉曼光譜圖Fig.2 SERS strength of norfloxacin-labeled molecularly imprinted polymers at 1 420 cm-1.(a) amount of graphene oxide(GO);(b) amount of dopamine hydrochloride(DA);(c) amount of norfloxacin(NOFX);(d) polymerization time;(e) Raman spectra of template molecule(NOFX) at different elution times

聚合時間是影響分子印跡聚合物SERS性能的重要因素，為了優(yōu)化聚合反應(yīng)時間，將基質(zhì)材料、功能單體、模板分子分散于20 mL Tris-HCl緩沖溶液中，持續(xù)攪拌不同時間(30、60、90、120、150 min)后，采集拉曼信號。如圖2d所示，隨著反應(yīng)時間的增加，拉曼信號逐漸增強，但當(dāng)反應(yīng)時間達到90 min時，拉曼信號增長趨于平緩。綜合考慮，90 min被認(rèn)為是最佳聚合時間并用于進一步實驗。為了考察分子印跡聚合物的最佳洗脫時間，將MIPs分散于甲醇-乙酸(9∶1,V/V)溶液中對模板分子諾氟沙星進行洗脫。如圖2e所示，隨著洗脫時間的增加，兩個特征峰的強度逐漸降低，當(dāng)洗脫時間達到4 h時，拉曼光譜圖可近似看做一條直線，幾乎觀察不到特征峰。說明模板分子已洗脫完全，因此認(rèn)為4 h為最佳洗脫時間。

2.2 掃描電鏡及透射電鏡表征

分別對制備的Fe3O4/GO、Fe3O4/GO/Ag和Fe3O4/GO/Ag-MIPs粒子進行掃描電鏡(SEM)及透射電鏡(TEM)表征，結(jié)果如圖3所示。其中，圖3a和3b為Fe3O4/GO的SEM及TEM表征結(jié)果，可以看出Fe3O4粒子基本呈球形，大小較為均一，且很好的附著在片狀氧化石墨烯表面，這得益于石墨烯具有極大的比表面積，可以很好的吸附Fe3O4粒子；圖3c和3d為Fe3O4/GO/Ag的SEM及TEM表征結(jié)果，可以看出原本光滑的Fe3O4粒子表面變得極為粗糙，且有很多小顆粒附著在表面，說明Ag粒子成功沉積到Fe3O4/GO表面；圖3e和3f為Fe3O4/GO/Ag-MIPs的SEM及TEM表征結(jié)果，可以看出Fe3O4/GO/Ag表面包覆了一層厚厚的膜狀物質(zhì)，即為分子印跡層，說明分子印跡聚合物成功包覆在了Fe3O4/GO/Ag表面，可用于進一步實驗。

圖3 掃描電鏡(a,c,e)和透射電鏡(b,d,f)圖。(a、b)Fe3O4/GO；(c、d)Fe3O4/GO/Ag；(e、f)Fe3O4/GO/Ag-MIPsFig.3 SEM(a,c,e) and TEM(b,d,f) images.(a,b) Fe3O4/GO;(c,d) Fe3O4/GO/Ag;(e,f) Fe3O4/GO/Ag-MIPs

2.3 能譜(EDS)表征

圖4分別為Fe3O4/GO、Fe3O4/GO/Ag以及Fe3O4/GO/Ag-MIPs的能譜(EDS)譜圖。其中，圖4a為Fe3O4/GO的EDS圖，F(xiàn)e、O元素來自于Fe3O4，C元素來自于石墨烯；圖4b為Fe3O4/GO/Ag的EDS圖，與圖4a相比，圖4b出現(xiàn)了新的譜峰，即為Ag，并且Fe、O、C元素的譜峰明顯降低，表明Ag粒子成功包覆在了Fe3O4/GO表面；圖4c為Fe3O4/GO/Ag-MIPs的EDS圖，與圖4b相比，F(xiàn)e、Ag元素的峰明顯降低，但C、O元素譜峰重新變高，并且出現(xiàn)了N元素的譜峰，證明分子印跡層成功包覆在Fe3O4/GO/Ag表面。EDS結(jié)果表明成功制備出了Fe3O4/GO/Ag-MIPs，可用于進一步實驗。

圖4 EDS譜圖。(a)Fe3O4/GO；(b)Fe3O4/GO/Ag；(c)Fe3O4/GO/Ag-MIPsFig.4 EDS spectra.(a) Fe3O4/GO;(b) Fe3O4/GO/Ag;(c) Fe3O4/GO/Ag-MIPs

圖5 X射線衍射圖。(a)Fe3O4；(b)Fe3O4/GO；(c)Fe3O4/GO/Ag；(d)Fe3O4/GO/Ag-MIPsFig.5 X-ray diffraction pattern.(a)Fe3O4；(b)Fe3O4/GO；(c)Fe3O4/GO/Ag；(d)Fe3O4/GO/Ag-MIPs

2.4 X射線衍射表征

圖5分別為Fe3O4、Fe3O4/GO、Fe3O4/GO/Ag以及Fe3O4/GO/Ag-MIPs的X射線衍射(XRD)譜圖。其中，曲線(a)為Fe3O4的XRD譜圖，在2θ=30°、35.4°、43°、56.9°及62.5°處出現(xiàn)了衍射峰，分別對應(yīng)于Fe3O4的(112)、(211)、(220)、(303)和(224)晶面；曲線(b)為Fe3O4/GO的XRD譜圖，相較于曲線(a)而言，曲線(b)的衍射峰位置沒有發(fā)生改變，但峰強度明顯降低，證明在氧化石墨烯表面成功附著Fe3O4粒子；曲線(c)為Fe3O4/GO/Ag的XRD譜圖，觀察可得，在2θ=38.2°、44.3°、64.5°和77.5°處出現(xiàn)了新的衍射峰，分別對應(yīng)于Ag的(111)、(200)、(220)和(311)晶面，證明Ag納米粒子成功沉積到了樣品表面；曲線(d)為Fe3O4/GO/Ag-MIPs的XRD譜圖，從圖中可以看出，曲線(d)的衍射峰位置沒有發(fā)生改變，但峰強度有所降低，特別是Fe3O4對應(yīng)的(211)晶面和Ag對應(yīng)的(111)晶面峰強度降低最為明顯，該結(jié)果證明聚合物成功聚合在樣品表面。

2.5 表面增強拉曼光譜性能研究

為了考察磁性分子印跡聚合物Fe3O4/GO/Ag-MIPs是否具有良好的吸附及SERS性能，實驗以諾氟沙星作為模板分子對其進行拉曼光譜檢測。圖6a為不同濃度的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的拉曼光譜圖，如圖所示分子印跡聚合物對不同濃度的諾氟沙星具有強的增強效應(yīng)，即使達到10-8mol/L時，仍然可以觀察到1 420 cm-1和1 655 cm-1處的兩個主要拉曼峰；進一步研究發(fā)現(xiàn)，1 420 cm-1處的吸收峰強度隨諾氟沙星濃度的梯度變化呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為:y=811.14x+6715.3，相關(guān)系數(shù)R2=0.9912(圖4b)，說明可以根據(jù)拉曼峰強度實現(xiàn)對諾氟沙星的定量分析；圖6c為諾氟沙星同一濃度下，引入磁場前后的拉曼信號峰對比圖，如圖所示引入磁場后，拉曼信號可以達到無外加磁場時的1.5～2倍，這一結(jié)果得益于引入磁場，可以實現(xiàn)對樣品的富集和團聚以及熱點的增強；圖6d為1.0×10-4mol/L的諾氟沙星在MIPs上重復(fù)吸附與洗脫(10次)的SERS圖，如圖所示諾氟沙星的拉曼峰強度無明顯變化，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.32%。說明磁性分子印跡聚合物具有良好的重復(fù)性，可供循環(huán)使用。

圖6 拉曼光譜圖。(a)不同濃度的NOFX在Fe3O4/GO/Ag-MIPs上的SERS;(b)不同濃度的NOFX在1 420 cm-1處拉曼峰強度標(biāo)準(zhǔn)曲線；(c)引入磁場與無磁場拉曼對比圖；(d)10-4 mol/L NOFX在Fe3O4/GO/Ag-MIPs上的重復(fù)性SERS圖；(e)Fe3O4/GO/Ag-MIPs和Fe3O4/GO/Ag-NIPs的選擇識別特性Fig.6 Raman spectra.(a) SERS of different concentration of NOFX on Fe3O4/GO/Ag-MIPs and its standard curve;(b)standard raman peak strength curve of NOFX with different concentrations at 1 420 cm-1;(c) Raman spectra with magnetic field and non-magnetic field;(d) repetitive SERS spectra of 1.0×10-4 mol/L NOFX on Fe3O4/GO/AgMIPs;(e) selective recognition characteristics of Fe3O4/GO/Ag-MIPs and Fe3O4/GO/Ag-NIPs

為了考察磁性分子印跡聚合物的選擇性，以氧氟沙星(OFX)、環(huán)丙沙星(CIP)、氨芐西林(AMP)、阿莫西林(AMX)和葡萄糖(Glucose)作為干擾物，進行拉曼檢測，如圖6e所示，與空白樣品相比，除目標(biāo)分子外，其他藥物幾乎沒有產(chǎn)生拉曼信號，由于OFX與CIP的結(jié)構(gòu)與NOFX相似，因此顯示弱的拉曼信號，但模板分子NOFX顯示出了很強的拉曼信號。這一結(jié)果表明，磁性分子印跡聚合物Fe3O4/GO/Ag-MIPs具有良好的選擇性，為選擇識別目標(biāo)樣品提供了良好的依據(jù)。

2.6 樣品分析

為了考察磁性分子印跡聚合物的實用性，實驗將所制備的磁性分子印跡聚合物用于對市售諾氟沙星膠囊的檢測。將諾氟沙星膠囊除去外衣后溶解于30 mL水溶液中(含1 mL HCl)，再將該溶液稀釋不同(102、103、104)倍數(shù)進行SERS檢測，結(jié)果如圖7所示。將檢測結(jié)果帶入線性方程計算可得，市售諾氟沙星膠囊中諾氟沙星的濃度為0.03 mol/L，即含量約為0.1克/粒，與說明書所示規(guī)格相符。由此證明，該磁性分子印跡聚合物可以用于實際樣品的檢測，磁性分子印跡聚合物具有較低的檢出限，可以達到10-7mol/L。

圖7 (A)不同濃度的實際樣品SERS檢測圖；(B)不同濃度的實際樣品在1 420 cm-1處的SERS信號值Fig.7 (A)SERS of actual samples with different concentrations;(B)SERS signal values at 1 420 cm-1 for actual samples with different concentrations

3 結(jié)論

本文以Fe3O4/GO/Ag為基質(zhì)材料、鹽酸多巴胺為功能單體、諾氟沙星為模板分子，制備出了磁性分子印跡聚合物。該聚合物具有良好的選擇吸附性能、重復(fù)性及較低的檢出限，可以實現(xiàn)對抗生素藥物的快速、準(zhǔn)確及無免疫檢測?？傊?，實驗制備的Fe3O4/GO/Ag-MIPs可以作為一種優(yōu)秀的SERS基底，在食品、化學(xué)和生物等的抗生素定量檢測中具有重要意義。