熊雅茹， 傅 紅， 楊 方

(1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350108;2.福州海關(guān)技術(shù)中心，福建福州 350001;3.福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350001 4.福州大學(xué)福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350108)

瑪卡(EpidiummeyeniiWalp)原產(chǎn)自秘魯，被稱為“秘魯人參”。2011年起成為我國的新資源食品[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，瑪卡具有抗疲勞和改善內(nèi)分泌等作用[2 - 4]，瑪卡中蛋白含量約為20%[5]，而蛋白質(zhì)是衡量食品營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)?，斂ǘ嚯氖怯涩斂ǖ鞍酌附夂笮纬傻钠?，含有較大比例的寡肽和氨基酸，具有一定的營養(yǎng)價(jià)值和生理功能[6]，目前國內(nèi)外少有對(duì)瑪卡多肽活性與功能的研究。

目前，蛋白質(zhì)提取主要有溶液提取、酶法提取、超聲波輔助提取、雙水相萃取、反微團(tuán)萃取等方法[7]。水溶液提取法是目前提取蛋白質(zhì)使用最廣的一種方法[8]，而響應(yīng)面分析法是一種非常有效的數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)方法相結(jié)合的數(shù)據(jù)分析手段。本文用堿提酸沉法提取瑪卡蛋白，先經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)，以蛋白提取率為指標(biāo)初步確定各因素的適宜水平，然后通過響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)堿法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，再通過多點(diǎn)測定蛋白等電點(diǎn)，最大程度提取瑪卡蛋白。胰蛋白酶、胃蛋白酶模擬消化酶解瑪卡蛋白，高分辨質(zhì)譜分析瑪卡多肽，Uniprot匹配其多肽序列與對(duì)應(yīng)生物來源、分子功能等，對(duì)進(jìn)一步了解瑪卡多肽與功能的對(duì)應(yīng)關(guān)系具有積極意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DIONEX UltiMate 3000超高效液相色譜：美國Dionex公司產(chǎn)品；四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Q-Exactive)：美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；全自動(dòng)定氮儀：Kjeltec 8400 Analyzer Unit；CR21N臺(tái)式冷凍離心機(jī)：日立公司產(chǎn)品；FreeZone?TriadTM2.5L冷凍干燥機(jī)：美國LABCONCO公司產(chǎn)品；UV-2700紫外-可見分光度計(jì)：日本島津儀器有限公司產(chǎn)品。

瑪卡：湖南省醫(yī)藥公司；Tris：生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品；胰蛋白酶：2.5×105U/g，廈門泰京生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；乙腈、甲酸、甲醇均為色譜純，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；三氯乙酸：分析純，國藥集團(tuán)產(chǎn)品；C18固相萃取柱(500 mg/3mL)：美國Supelco公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 瑪卡蛋白含量及提取率的測定瑪卡原料的蛋白質(zhì)含量參照國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 5009.5-2010)中的凱氏定氮法測定，考馬斯亮藍(lán)法測定堿液提取法上清液中蛋白質(zhì)含量。堿法提取蛋白得率為堿提上清液中蛋白質(zhì)含量與原料中蛋白質(zhì)含量的比值。

1.2.2 瑪卡中多肽的提取瑪卡原料粉粹過80目篩，按料液比1∶45(g∶mL)加入pH=10的Tris-HCl緩沖液，40 ℃水浴70 min，取出于4 ℃、18 000 r/min離心10 min，取上清液用0.5 mol/L HCl調(diào)節(jié)至有絮狀沉淀，再于4 ℃、18 000 r/min離心10 min，棄上清液取沉淀，-70 ℃預(yù)凍12 h后，-80 ℃真空冷凍干燥2 d，得瑪卡凍干蛋白[9]。分別取瑪卡凍干蛋白0.2 g溶于10 mL超純水中，以0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0～8.5，分別加入1.6×104U胰蛋白酶、胃蛋白酶于37 ℃、40 ℃水浴酶解4 h后，沸水浴10 min滅酶活[10]，4 ℃、18 000 r/min離心10 min，取上清液備用。C18固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化。取上清液3 mL過柱，用10 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，45 ℃氮吹至近干，用1 mL 0.1%甲酸水溶液溶解，過0.45 μm濾膜，待測[11]。

1.2.3 儀器條件色譜條件：Hypersil GOLD UPLC C18柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈。洗脫梯度：0～50 min，10%～90%B；50～55 min，90%B；55～56 min，90%～10%B；56～60 min，10%B；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)：載氣為高純氮?dú)?純度>99.5%)，鞘氣流速40個(gè)單位(arb)，輔氣流速15個(gè)單位(arb)，吹掃氣流速0個(gè)單位；噴霧電壓3.2 kV；碰撞池采用梯度碰撞能量：25%、35%、55%；毛細(xì)管溫度320 ℃，離子透鏡電壓頻率(S-lens RF level)為60，輔氣熱源溫度350 ℃[12]。掃描模式：Full MS/dd-MS2，分析時(shí)長60 min，檢測方式：正離子，母離子掃描范圍：m/z100～1 500，一級(jí)質(zhì)譜分辨率：70 000 atm/z，AGG target:le6，一級(jí)Maximum IT:100 ms，掃描范圍數(shù):1，動(dòng)態(tài)排除(Dynamic exclusion):40.0 s一次，MS2解離模式:HCD，隔離窗口:0.4m/z；二級(jí)質(zhì)譜分辨率：17 500 atm/z200，微掃描:1，二級(jí)Maximum IT:50 ms，碰撞能量:30 eV，欠填比:0.1%。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析采用MaxQuant(版1.6.1.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。搜索針對(duì)包含來自Uniprot的瑪卡(uniprot-Brassicaceae.fasta)的661726種蛋白質(zhì)序列(https://www.uniprot.org，2018年10月28日下載)數(shù)據(jù)庫。蛋白FDR設(shè)置為0.01；最小氨基酸長度設(shè)置為3；可變修飾設(shè)為N-Acetyl和Oxidation(M)；固定化修飾設(shè)置為Carbamidomethyl(C)；酶的設(shè)置分別選擇非專一性和專一性，其中專一性酶分別設(shè)置為胰蛋白酶、胃蛋白酶；最大裂解丟失設(shè)置為2，所有常見的污染物和相反的命中被刪除[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件探討

實(shí)驗(yàn)選取對(duì)蛋白提取率影響較為顯著的提取緩沖液濃度、提取時(shí)間、提取液的pH值、提取料液比、提取溫度5種因素進(jìn)行了探討。其中，提取緩沖液濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08和0.1 mol/L；提取時(shí)間分別為30、40、50、60和70 min；提取液pH值分別7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10；提取料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40和1∶45(g∶mL)；提取溫度分別為30、40、50、60和70 ℃。結(jié)果表明：一定范圍內(nèi)鹽溶液增加，蛋白質(zhì)分子表面電荷隨之增加，蛋白質(zhì)-水相互作用增強(qiáng)，促進(jìn)蛋白溶解度增加，超出該范圍會(huì)破壞蛋白膠體性質(zhì)使其溶解度降低，故最佳提取緩沖液濃度為0.06 mol/L。隨著提取時(shí)間的增長，提取率先緩慢增加后降低，可能是蛋白質(zhì)的沉淀或分解導(dǎo)致的，70 min時(shí)有最大值35.96%。提取率隨時(shí)間變化的幅度非常平緩，影響不顯著，綜合考慮最優(yōu)提取時(shí)間40 min。pH=7.5～10.0內(nèi)，隨著pH增高，提取率以漸慢增長幅度隨之增大，pH=10.0時(shí)提取率達(dá)最大值35.26%，約為pH=7.5時(shí)的1.7倍，在pH=8.0后總體變化趨勢較平緩，考慮選取最佳提取pH=10.0。蛋白質(zhì)在特定溶液中溶解度一定，達(dá)到該提取料液比時(shí)，能溶解的蛋白全部溶出且剛好達(dá)到或仍未達(dá)飽和，此時(shí)增大提取液體積，提取率不再升高，反而給后續(xù)廢水處理造成麻煩[13]，故1∶40(g∶mL)為最佳提取料液比。30～40 ℃時(shí)，提取率隨溫度的升高顯著增大，之后增勢較緩，60 ℃時(shí)提取率達(dá)最大值36.64%，溫度升至70 ℃時(shí)，部分蛋白質(zhì)變性沉淀導(dǎo)致提取率降低，故最佳提取溫度為60 ℃。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出5個(gè)因素中對(duì)瑪卡蛋白提取率影響較為顯著的水平范圍，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)將結(jié)果突出的實(shí)驗(yàn)水平重新組合，探究各因素間交互作用對(duì)結(jié)果的影響。選取對(duì)瑪卡蛋白提取影響較大的3個(gè)因素，提取液Tris-HCl濃度(A)、提取溫度(B)和提取料液比(C)3個(gè)因素建立3因素3水平的試驗(yàn)，并得出瑪卡蛋白提取最佳工藝條件，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

2.2.2 響應(yīng)面分析綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以蛋白提取率Y為響應(yīng)值，提取緩沖液濃度A，提取溫度B，提取料液比C三因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，所得結(jié)果見表2?，斂ǖ鞍滋崛÷史秶?4.08%～45.63%，緩沖液濃度0.06 mol/L、提取溫度70 ℃、提取料液比為1∶45時(shí)所得瑪卡蛋白最多。利用Design-Expert 10數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)表2所列瑪卡蛋白提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次效應(yīng)面回歸分析，所得擬合方程如下：

Y=34.61-0.69A+3.44B+4.66C-0.22AB+0.23AC-0.40BC+3.33A2+2.87B2-2.22C2

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型方差及可信度分析表

圖1反映了Tris-HCl濃度(A)、提取溫度(B)、提取料液比(C)3個(gè)因素之間的交互作用對(duì)瑪卡蛋白提取率的影響。響應(yīng)面能較直觀地體現(xiàn)其他條件固定時(shí)各交互項(xiàng)對(duì)提取率的影響，圖中曲線走勢越陡，該因素對(duì)提取率影響越大；走勢平滑，則影響較小。等高線的形狀反映兩因素交互作用的程度，橢圓形說明交互作用顯著，若為圓形則反之[16]。由圖1(A)可知，因素A及因素B的等高線形狀近似為圓形，表明其對(duì)蛋白提率無顯著交互作用，這與方差分析結(jié)果相一致。圖1(B)中可知因素C在相應(yīng)曲面上的坡度比因素A對(duì)應(yīng)的曲面更陡，說明對(duì)應(yīng)范圍內(nèi)的料液比對(duì)提取率的影響比Tris濃度更為顯著。而圖1(C)中在溫度高于60 ℃后，等高線越趨密集，說明隨著溫度升高，因素B對(duì)提取率的影響漸為顯著，因素B及C值增加對(duì)提率影響愈顯著。

圖1 Tris濃度(A)、提取溫度(B)和料液比(C)對(duì)瑪卡蛋白提取率的交互作用Fig.1 Interaction of Tris concentration(A),extraction temperature(B) and material-liquid ratio(C) on Maca protein extraction

2.2.3 響應(yīng)面驗(yàn)證由Design-Expert根據(jù)建立的模型得到的優(yōu)化組合及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，瑪卡蛋白最佳提取工藝條件為：Tris-HCl濃度0.04 mol/L，提取溫度70 ℃，pH=10.0，提取時(shí)間40 min，料液比1∶44.03(g∶mL)。根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整為Tris-HCl濃度0.04 mol/L，提取溫度70 ℃，pH=10，提取時(shí)間40 min，料液比1∶45(g∶mL)，做3次平行試驗(yàn)，蛋白提率為45.69%，與模型預(yù)測理論值46.49%接近。表明該回歸模型能較好的預(yù)測瑪卡蛋白提取率，得到的提取工藝參數(shù)科學(xué)可靠。

2.3 等電點(diǎn)測定結(jié)果

蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)狀態(tài)時(shí)會(huì)被凝集沉淀下來，此時(shí)蛋白沉淀量最高，因此多點(diǎn)測定堿法提取后上清液中蛋白等電點(diǎn)。分別取等量堿提后上清液，以0.5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH，沉淀后再次離心，考馬斯亮藍(lán)法測沉淀前后上清液中蛋白質(zhì)含量，上清液中蛋白質(zhì)殘留率最低時(shí)的pH值即為瑪卡蛋白等電點(diǎn)[17]。從表4可知，pH=2.0～3.0時(shí)，蛋白質(zhì)沉淀效果較佳。綜合數(shù)據(jù)，pH=2.5為瑪卡蛋白質(zhì)等電點(diǎn)。

表4 瑪卡蛋白等電點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 酶解條件優(yōu)化

常規(guī)的酶解反應(yīng)往往需要12 h以上，工作效率低，且易引發(fā)副反應(yīng)。從生理學(xué)上看，人體正常消化時(shí)間為4～6 h，且主要經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶作用[19]。鑒于此，本文分別考察了胰蛋白酶、胃蛋白酶的酶解條件，結(jié)果表明酶解時(shí)間為4 h時(shí)的效果較好。

2.5 肽段鑒定結(jié)果

瑪卡蛋白經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶分別酶解，經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜3次重復(fù)檢測分析，Maxquant軟件處理液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)，胰蛋白酶、胃蛋白酶三次酶解后的共有肽段所得結(jié)果見表5、表6。

以胰蛋白酶酶解進(jìn)行3次重復(fù)檢測獲得共鑒定14條共有肽段，其中找到生物來源的有4條。其中來源于BnaAnng34060D蛋白的LSANIDGLSR，具有脂肪酶活性，參與脂質(zhì)代謝過程；SAPIVSGVKKPHR來源于組蛋白H3，可與DNA結(jié)合，具有蛋白質(zhì)異二聚化活性。以胃蛋白酶酶解進(jìn)行3次重復(fù)檢測獲得共鑒定19條共有肽段，能找到生物來源的有5條，多屬于酶類。ITLFDYYR來自于tRNA合成酶II類(D，K和N)家族蛋白，具有氨酰-tRNA連接酶活性，參與用于蛋白質(zhì)翻譯的tRNA氨?；^程；LFVSNGELK來自于谷胱甘肽水解酶2，具有催化活性，參與谷胱甘肽代謝途徑，是硫代謝的一部分；來自醛脫氫酶的VFGAVEASDLVK具有氧化還原酶活性，作用于供體的醛或氧代基團(tuán)，NAD或NADP作為受體，參與細(xì)胞醛代謝過程；VGITKAAHQQR來自于生長素響應(yīng)因子，參與生長素激活信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物過程。

綜合數(shù)據(jù)，瑪卡多肽經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶分別酶解得到的序列不盡相同，但多肽均主要來源于油菜、甘藍(lán)等植物。所檢測的瑪卡多肽主要集中在6～13個(gè)氨基酸之間，最長的是來自Noccaeacaerulescens(高山扁豆)的SAPIVSGVKKPHR，但檢測的瑪卡多肽數(shù)量仍較少，且生物功能不顯著，后續(xù)可再進(jìn)行研究探討。

表5 瑪卡胰蛋白酶3次酶解共有肽段

表6 瑪卡胃蛋白酶3次酶解共有肽段

3 結(jié)論

本文用響應(yīng)面法優(yōu)化得到了瑪卡蛋白提取的最優(yōu)方案。進(jìn)一步模擬消化過程，胰蛋白酶、胃蛋白酶分別單獨(dú)酶解瑪卡蛋白，UPLC-Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，所得結(jié)果經(jīng)Uniprot搜庫匹配分析，共檢測出6條有明確生物來源以及分子功能的多肽，這些多肽多存在于同種屬的甘藍(lán)、擬南芥等植物中，分子功能與生物活性不一，但總體而言檢測到的多肽數(shù)量仍然較少，呈現(xiàn)的功能活性有限，推測是因?yàn)槊附猬斂ǖ鞍椎淖钸m酶是堿性蛋白酶而非模擬消化過程中的胰蛋白酶、胃蛋白酶。雖然瑪卡多肽曾被認(rèn)為有較強(qiáng)的功效，但目前為止尚未有明確證據(jù)支持，而這也與我們的檢測結(jié)果相一致。目前采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究瑪卡多肽的報(bào)道較少，本文可為瑪卡多肽的研究提供新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。