王天琦， 馬兆成， 吳軍民， 王建國， 余瓊衛(wèi)*， 馮鈺锜

(1.生物醫(yī)學分析化學教育部重點實驗室，武漢大學化學與分子科學學院，湖北武漢 430072；2.華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院 園藝生物學教育部重點實驗室，湖北武漢 430070；3.青海芝潤農(nóng)林開發(fā)有限公司，青海格爾木 816099；4.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100)

圖1 花青素的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of anthocyanins

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)為茄科(Solanceae)枸杞屬(LyciumL.)多年生灌木，廣泛分布于我國西北地區(qū)，其果實中富含花青素，具有抗氧化、抗癌、維持血管通透性的作用[1]?；ㄇ嗨貙儆陬慄S酮物質(zhì)，具有2-苯基苯并吡喃陽離子的典型結(jié)構(gòu)(圖1)，是植物的主要水溶性色素之一。目前已知有20多種花青素，而植物中的花青素主要有6種，分別為天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素[2]?；ㄇ嗨卦谥参镏型ǔ２环€(wěn)定，不會以游離態(tài)形式存在，而是與糖類物質(zhì)結(jié)合形成糖苷，稱為花色苷。糖環(huán)上剩余的羥基又會與酸發(fā)生?；磻@大大增加了花色苷類物質(zhì)的穩(wěn)定性[3]。通過提取植物中花青素苷并對其進行分析，可以間接地了解植物中花青素的情況。

黑枸杞中花青素的提取多采用溶劑提取法，由于花青素在pH>3的環(huán)境中不穩(wěn)定，用酸化的甲醇或乙醇與水的混合溶劑，輔以超聲、微波、水浴等協(xié)助提取[4,5]。還有部分研究采用微生物法[6]，即利用微生物或酶降解細胞壁，使細胞內(nèi)的花青素釋放出來，達到快速測定花青素的目的。關(guān)于溶劑提取法，目前已有多篇文獻報道用以提取花青素，但這些報道中用到的溶劑、酸度、輔助方式均不相同，很難達到統(tǒng)一[3,7 - 12]。花青素的測定方法主要有分光光度法[7,12]、高效液相色譜法[13 - 15]、質(zhì)譜法[16]。然而，由于這些花色苷是復雜的糖基化、?；幕衔?，提純和合成都較困難，無法得到標準品[17]，因而多采用已有的花色苷標準品進行儀器分析做線性標準曲線，然后再將該線性曲線用于沒有標準品結(jié)構(gòu)相似的花青素苷的半定量分析。Zheng等[3]用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS)從黑枸杞提取液中鑒定出14種花色苷，并以錦葵色素-3,5-2-O -葡萄糖苷(Malvidin-3,5-di-O -glucoside)對這14種花色苷進行半定量分析。

本文首先通過高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜分離鑒定，確證提取液色譜圖中各個峰的結(jié)構(gòu)，確定其中的花色苷，再以高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)對其進行提取條件的優(yōu)化及分析。在優(yōu)化后的提取條件下，以矢車菊素-3-O -葡萄糖苷(Cyanidin-3-O -glucoside)為對照品對黑枸杞中總花色苷進行了半定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

Shimadzu 20A高效液相色譜儀(日本，島津公司)；Shimadzu 8040 MS質(zhì)譜儀(日本，島津公司)。

標準品矢車菊素-3-O -葡萄糖苷(Cyanidin-3-O -glucoside)購自上海麥克林生化科技有限公司。色譜純甲醇購自美國TEDIA試劑公司；甲醇、乙醇、甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水由Milli-Q超純水儀制備。

黑枸杞購自湖北省武漢市超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的制備稱取5.0 mg標準品矢車菊素-3-O -葡萄糖苷(Cyanidin-3-O -glucoside)，置于15.0 mL棕色安普瓶中，加入5.0 mL 1%HCl酸化的甲醇溶液超聲溶解，得到1 mg/mL的標準品儲備液，于-20 ℃避光冷藏。

1.2.2 黑枸杞中花色苷的提取稱取黑枸杞樣品7 g于小燒杯中，45 ℃下置于真空干燥箱中干燥72 h，將干燥后的黑枸杞置于研缽中，加入液氮磨碎成粉末，于-20 ℃避光保存。準確稱取50 mg黑枸杞粉末于1.5 mL離心管中，以1∶15的液料比加入750 μL 2%甲酸甲醇(甲酸∶甲醇=2∶98)，于室溫下避光浸提24 h。8 000 r/min離心10 min，取上清液進入HPLC儀檢測。

1.2.3 色譜及質(zhì)譜條件色譜條件：上海譜寧科技公司Pntulips SBP-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d.,5 μm)。流動相A為甲醇，B為含0.5%甲酸水溶液。梯度淋洗程序：0～3 min，80%～70%B；3～13 min，70%～60%B；13～25 min，60%～50%B，25～35 min，50%B；35～40 min，50%～80%B；40～60 min，50%～80%B；流速為0.8 mL/min。柱溫30 ℃；檢測波長為525 nm；進樣量為10 μL。質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離、正離子掃描，掃描范圍為0～1 200 Da，脫溶劑(DL)管溫度250 ℃，加熱模塊溫度400 ℃，霧化氣流速3 mL/min，干燥氣流速15 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 花色苷質(zhì)譜鑒定

圖2 黑枸杞提取液的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of L.ruthenicum extractsflow rate:0.8 mL/min;column temperature:30 ℃;wavelength:525 nm;injection amount:10 μL.The mobile phase of the gradient elution was as shown in 1.2.3.

圖2為黑枸杞中花色苷提取液的色譜分離圖，圖中主要有9個色譜峰，用島津8040質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜鑒定。對于圖2中的9個色譜峰，根據(jù)其得到的全掃描質(zhì)譜以及二級質(zhì)譜圖，可以得到相對應的結(jié)構(gòu)信息。經(jīng)過結(jié)構(gòu)解析與文獻報道[3,15,18,19]對比，4號峰(P4)與7號峰(P7)鑒定為花色苷，分別為矮牽?；?3-O -蕓香糖苷(葡糖基-P-香豆?；?-5-O -葡萄糖苷(Petunidin-3-O -rutinoside(glucosyl-p-coumaroyl)-5-O -glucoside)和矮牽?；?3-O -蕓香苷-5-O -葡萄糖苷(Petunidin-3-O -rutinoside(p-coumaroyl)-5-O -glucoside)，且其峰面積之和占總峰面積的90%左右。之后，依據(jù)P4和P7的峰面積之和對黑枸杞中花色苷總量進行半定量分析。

P4的二級質(zhì)譜圖見圖3A，分子離子峰的質(zhì)荷比為1094.8，丟失C5上連接的一個葡萄糖分子后得到的離子質(zhì)荷比為932.9，丟失C3上連接的蕓香糖、對香豆酸、葡萄糖得到的離子質(zhì)荷比為478.8，最后得到的牽?；ㄉ貫橘|(zhì)荷比317.0的峰。P7的二級質(zhì)譜圖見圖3B，分子離子峰的質(zhì)荷比為933.0，丟失C5上連接的一個葡萄糖分子后得到的離子質(zhì)荷比為771.0，丟失C3上連接的蕓香糖、對香豆酸得到的離子質(zhì)荷比為478.8，最后得到的牽?；ㄉ貫橘|(zhì)荷比317.0的峰。

圖3 花色苷的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of anthocyaninsA:Petunidin-3-O -rutinoside(glucosyl-p-coumaroyl)-5-O -glucoside;B:Petunidin-3-O -rutinoside(p-coumaroyl)-5-O -glucoside.

2.2 花色苷提取的優(yōu)化

從黑枸杞中提取花色苷的方法多種多樣，涉及到多種提取溶劑如甲醇、乙醇、水，也有多種提取方法如浸提、超聲、微波等被報道[3,7 - 12]。由于花色苷在中性及堿性條件下不穩(wěn)定，易發(fā)生分解，多在提取液中加入酸。選取了如下7種方法對黑枸杞中花色苷的提取進行優(yōu)化，具體參數(shù)見表1。按照表1進行提取操作后，得到的上清液進行HPLC-UV分離檢測。檢測結(jié)果見圖4，橫坐標為提取方法序號。1號、5號、6號方法的提取效果較好，3、7號方法的提取效果較差。綜合考慮實驗操作的安全性、實驗效果等方面，在之后的實驗中采取1號方法進行提取。

表1 黑枸杞中花色苷提取方法

圖4 花色苷的提取優(yōu)化Fig.4 Optimization of anthocyanins extraction methods1-7 represented seven different extraction methods shown in Table 1,respectively.

2.3 標準工作曲線

分別以2%甲酸甲醇溶液為溶劑配制濃度為0.020、0.050、0.080、0、100、0.200、0.800 mg/mL的矢車菊素-3-O -葡萄糖苷標準溶液。按照優(yōu)化條件進行HPLC-UV檢測。以峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標，得到線性回歸方程為：y=2.00×107x-15 691，相關(guān)系數(shù)R2為0.9996。以3倍信噪比(S/N=3)計算得到儀器檢出限為0.17 μg/mL，以S/N=10得到定量限為0.56 μg/mL。

在后續(xù)的計算中將P4與P7的峰面積之和代入線性回歸方程，得到的花色苷總濃度單位為mg Cy/g黑枸杞(Cy指代矢車菊素-3-O -葡萄糖苷)。

2.4 方法學考察

2.4.1 穩(wěn)定性實驗取同一矢車菊素-3-O -葡萄糖苷標準品溶液，分別放置0、1、2、3、4、5、6、10、16、24 h后進行檢測，計算樣品中總花色苷峰面積的相對標準偏差(RSD)為1.76%，表明花色苷樣品在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定(表2)。

2.4.2 回收率實驗向提取前的黑枸杞試樣中加入濃度為1 mg/mL的標準溶液75 μL，與未加標的黑枸杞試樣一樣處理，得到上清液后，向未加標的試樣中加入等量標品，進入HPLC檢測。重復三次，回收率為89.18%，RSD為5.72%，見表2。均可滿足檢測要求。

2.4.3 精密度實驗按照提取方法進行黑枸杞中花色苷的提取，重復三次，得到花色苷峰面積的日內(nèi)精密度為1.96%；于3 d內(nèi)連續(xù)進行此實驗，得到日間精密度為7.37%(表2)。均符合檢測要求。

表2 分析方法的精密度、穩(wěn)定性以及加標回收率

2.5 實際樣品分析

購買10種不同品牌黑枸杞產(chǎn)品，產(chǎn)地均為青海省，分別編號1～10，按擬定方法進行提取，優(yōu)化方法進行檢測，結(jié)果列于表3。這10種黑枸杞均產(chǎn)自青海省，但來自不同的市、區(qū)，主要為海西蒙古藏族自治州(格爾木市、諾木洪)和果洛藏族自治州，他們的價格差異巨大。一般來說，野生的黑枸杞價格貴于種植的，且顆粒越大價格越高。按照行業(yè)標準，顆粒直徑3～4 mm的為小果，4～6 mm為中果，6～8 mm為大果。根據(jù)單因素方差分析結(jié)果，10種黑枸杞中花色苷含量存在顯著性差異，說明不同品牌之間的黑枸杞花色苷含量差異巨大。將5、7、9號樣品歸于一組，為中果組，6、8、10號樣品歸于一組，為大果組，進行統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)之間并不存在顯著性差異，且同一品牌不同大小黑枸杞中也不存在顯著性差異，即黑枸杞中總花色苷的含量與黑枸杞的顆粒大小并無明確關(guān)系。

表3 黑枸杞實際樣品中花色苷檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本文對提取液中的花色苷進行質(zhì)譜鑒定，鑒別出兩種花色苷，分別為矮牽牛基-3-O -蕓香糖苷(葡糖基-P-香豆?；?-5-O -葡萄糖苷和矮牽?；?3-O -蕓香苷-5-O -葡萄糖苷，均含有牽?；ㄉ亍嶒炘谇叭说幕A(chǔ)上對比優(yōu)化了黑枸杞中總花色苷的提取方法，最終采取以2%甲酸甲醇為溶劑，常溫下避光浸提24 h的方法。隨后建立了黑枸杞中總花色苷的半定量方法，以矢車菊素-3-O -葡萄糖苷標準品溶液建立工作曲線，方法學考察結(jié)果良好。檢測了10種不同品牌的黑枸杞產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)總花色苷含量均在2.0 mg Cy/g黑枸杞以上，且不同品牌之間差異巨大。但是花色苷含量與黑枸杞顆粒大小、實際售賣價格均無明顯關(guān)系。