宋立新， 張云霞， 芮超凡， 何 娟*， 谷立峰

(1.河南水利與環(huán)境職業(yè)學(xué)院，河南鄭州 450000 2.河南工業(yè)大學(xué)，河南鄭州 450001；3.河南省科學(xué)院生物研究所有限責任公司，河南鄭州 450000)

赭曲霉毒素是一類結(jié)構(gòu)類似的真菌毒素，包括7種毒性物質(zhì)。其中以赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)毒性最大，對農(nóng)產(chǎn)品的污染最重，與人類生活密切相關(guān)[1]。赭曲霉毒素A是一種具有多種毒性的真菌毒素，是真菌同化異化產(chǎn)生的一種有毒次級代謝物[2]。赭曲霉毒素A的污染范圍廣泛，特別是對小麥、玉米、大豆、高粱等農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)生直接和間接污染，會在農(nóng)作物、植物及其產(chǎn)品的儲藏、運輸與加工過程中產(chǎn)生[3]。為了有效預(yù)防和控制赭曲霉毒素A的污染，保證食品安全，必須嚴格把控食品中赭曲霉毒素A的含量。目前，赭曲霉毒素A的分析檢測方法主要有薄層色譜法、免疫親和柱-高效液相色譜法等[4 - 6]。樣品前處理技術(shù)對于分析檢測至關(guān)重要，而且在復(fù)雜樣品中痕量赭曲霉毒素A的分析中要求更為嚴格[7]。近年來，分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)以其精確、特異性的吸附能力、高重復(fù)性、低檢出限、又不易受復(fù)雜樣品基體干擾的特點，正被逐漸應(yīng)用于痕量物質(zhì)的前處理中，彌補了傳統(tǒng)固相萃取和免疫分析的不足[8 - 10]。

圖1 赭曲霉毒素A(OTA)和氯霉素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of OTA and chloramphenicol

由于赭曲霉毒素A有較強毒性和致癌性，且赭曲霉毒素A標準品價格極其昂貴，所以本文選用赭曲霉毒素A的結(jié)構(gòu)相似物氯霉素作為替代模板，采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法[11,12]合成MIPs，赭曲霉毒素A和氯霉素的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。將該MIPs作為柱填料制成固相萃取柱，替代免疫親和柱對樣品中的赭曲霉毒素A進行富集凈化，然后利用高效液相色譜-熒光檢測法進行檢測。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

JASOV-750紫外-可見分光光度儀(日本，島津公司)；Waters 2695高效液相色譜儀(美國，沃特世公司)；Waters2475熒光檢測器(美國，沃特世公司)。

氯霉素(天津希恩恩生化科技有限公司)；標準赭曲霉毒素A(OTA，上海阿拉丁試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，天津賽孚瑞)；偶氮二異丁腈(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑)；甲基丙烯酸縮水甘油酯(上海麥克林試劑有限公司)。實驗用水為超純水。

1.2 高效液相色譜條件

色譜柱：C18柱，柱長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm；流動相：乙腈-水-冰乙酸(49.5+49.5+1)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；熒光檢測：激發(fā)波333 nm，發(fā)射波長460 nm。

1.3 分子印跡聚合物的合成

稱取0.15 g氯霉素，加入盛有150 mL無水乙醇的三口燒瓶中，振蕩溶解，加入308.75 μL甲基丙烯酸縮水甘油酯，885.65 μL乙二醇二甲基丙烯酸酯，5.75 μL氯化芐(單體和交聯(lián)劑總質(zhì)量的0.5%)，通入氮氣5 min，加16.83 mg CuCl，在機械攪拌下繼續(xù)通氮氣5 min，逐漸升溫至86 ℃后，反應(yīng)6 h，過濾得到MIPs。非印跡聚合物(Non-Imprinted Polymers，NIPs)的合成除不加氯霉素模板，其他步驟與MIPs的合成步驟一樣。

將MIPs用濾紙包好，置于索氏抽提器中。加入甲醇-乙酸(4∶1，V/V)混合提取液，95 ℃下回流洗脫至回流液中檢測不到氯霉素的紫外吸收峰；換純甲醇洗脫除去殘留乙酸，烘干備用。

1.4 吸附性能檢測

1.4.1 等溫吸附實驗稱取10 mg的MIPs和10 mg NIPs，分別置于5 mL離心管中，再加入3 mL的0.1～30 μg/mL不同濃度的赭曲霉毒素A溶液(乙腈∶水=1∶9，V/V)，靜態(tài)吸附8 h后，用高效液相-熒光檢測器測定上清液中游離赭曲霉毒素A濃度。根據(jù)公式計算吸附容量(Q，μg/mg)：Q=(c0-c)×V/m。式中Q為聚合物對赭曲霉毒素A的吸附容量，μg/mg；c0為吸附前赭曲霉毒素A溶液濃度，μg/mL；c為吸附后的赭曲霉毒素A溶液濃度，μg/mL；V為加入到聚合物中赭曲霉毒素A標準溶液的體積，mL；m為聚合物質(zhì)量，mg。

1.4.2 吸附速率實驗稱取12份10 mg MIPs置于5 mL離心管中，每份樣品中加入3 mL 10 μg/mL的赭曲霉毒素A溶液(乙腈∶水=1∶9，V/V)，1～7號分別吸附5、10、30、40、50、60、90 s，8～12號分別吸附2、3、4、5、6 min。計算吸附不同時間后聚合物的吸附容量大小。

1.5 實際樣品分析

1.5.1 固相萃取柱的制備稱取100 mg 聚合物，用20 mL甲醇，濕法裝于直徑8 mm、長8 cm的固相萃取小柱中，萃取柱的兩端(頂端和底部)均用聚四氟乙烯隔墊封口。

1.5.2 實際樣品制備根據(jù)國家標準(GB/T 30955-2014)中的方法處理飼料樣品：稱取50 g粒度小于1 mm 的飼料樣品于250 mL錐形瓶中，加入5 g NaCl和100 mL甲醇水溶液(8∶2,V/V)，超聲振蕩30 min，過濾。取10 mL濾液用40 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS：8 g NaCl，1.2 g Na2HPO4，0.2 g KH2PO4，0.2 g KCl，純水稀釋，HCl調(diào)節(jié)pH=7.0，純水定容至1 000 mL)稀釋。用纖維濾紙過濾，濾液備用。

1.5.3 自制固相萃取柱和免疫親和柱的對比分別用免疫親和柱和分子印跡固相萃取柱，對加入標準赭曲霉毒素A溶液的飼料提取液進行萃取富集。為保證自制固相萃取柱與免疫親和柱的對比，因此免疫親和柱和自制柱的使用操作保持一致。柱子使用前先用10 mL甲醇，2 mL純水活化后，上樣3 mL含有赭曲霉毒素A的樣品提取液，控制流速為1 mL/min，然后用10 mL純水淋洗，最后用1 mL甲醇洗脫。洗脫液使用高效液相色譜-熒光檢測器測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗優(yōu)化

對溫度，模板與單體的摩爾比，模板與交聯(lián)劑摩爾比，引發(fā)劑用量4種因素做了優(yōu)化實驗。在單因素優(yōu)化實驗中得到的條件是溫度86 ℃，模板∶單體∶交聯(lián)劑=1∶5∶10(摩爾比)，引發(fā)劑用量為0.5%。

2.2 正交實驗優(yōu)化

為了進一步優(yōu)化聚合物的實驗條件，進行了正交試驗，如表1所示：因素A為反應(yīng)溫度；因素B為模板與單體的摩爾比例；因素C為模板與交聯(lián)劑的摩爾比例；因素D為引發(fā)劑用量(單體與交聯(lián)劑質(zhì)量之和的百分比)。從表1中得出極差大小順序RC>RD>RB>RA，即模板與交聯(lián)劑的摩爾比例對合成的產(chǎn)物影響最大。從各組實驗產(chǎn)物的吸附量來看，編號8的吸附容量最大為3.992 μg/mg，即最佳合成條件應(yīng)為A3B2C1D1，跟單因素試驗得出的最佳合成條件一致。故最佳合成條件為溫度86 ℃，模板∶單體∶交聯(lián)劑為1∶5∶10(摩爾比)，引發(fā)劑的量為0.5%。

表1 正交實驗優(yōu)化

2.3 聚合物的表征

2.3.1 掃描電鏡圖2為MIPs在不同放大倍數(shù)下的掃描電鏡圖。由圖可以看出：MIPs的整體呈蓬松狀，由顆粒直徑在0.5 μm左右的聚合物顆粒組成，較小的聚合物顆粒擁有更大比表面積，為MIPs良好的吸附性能提供了基礎(chǔ)。

圖2 MIPs的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscope images of MIPs A:×2.00 K;B:×30.00 K.

圖3 MIPs和NIPs的紅外譜圖Fig.3 Infrared spectra of MIPs and NIPs

2.3.2 傅里葉變換紅外光譜如圖3所示：MIPs在3 656 cm-1處有一個較寬的峰，是由-OH的伸縮振動引起的。在2 990 cm-1處的吸收峰由甲基中C-H伸縮振動引起。在1 740 cm-1處比較強的吸收峰是由羰基的C=O雙鍵引起的。從MIPs和NIPs的紅外圖譜比較來看，無明顯差別，說明在洗脫過程中模板分子已被洗脫下來。

2.4 聚合物的吸附性能

圖4 MIPs和NIPs的吸附性能Fig.4 Adsorption properties of MIPs and NIPsA:Isothermal adsorption of MIPs and NIPs; B:Adsorption rates of MIPs and NIPs.

圖5 赭曲霉毒素A(OTA)標準溶液、自制分子印跡固相萃取(MISPE)柱和免疫親和柱(IAC-OTA-WB)色譜圖Fig.5 Chromatograms of standard solution before and after extraction by self-made column(MISPE) and immune affinity column(IAC-OTA-WB)

研究MIPs和NIPs對不同濃度的赭曲霉毒素A溶液的吸附性能，測定0.1～30 μg/mL條件下的等溫吸附。由圖4A可知，當赭曲霉毒素A的濃度不斷增加時，MIPs和NIPs的吸附容量也在不斷地增大，赭曲霉毒素A增大到一定濃度時，吸附量的增加速率減緩?？傮w來說MIPs的吸附容量比NIPs的吸附容量大。圖4B所示為MIPs和NIPs對赭曲霉毒素A的吸附容量隨時間的變化曲線。吸附容量隨著吸附時間的增加呈現(xiàn)正增長趨勢，一定時間后，趨于穩(wěn)定，此時聚合物達到吸附平衡。由圖4B中可以知道MIPs對赭曲霉毒素A的吸附速率非常迅速，吸附容量在4、5、6 min相差很小，即在4 min基本達到吸附平衡，這為固相萃取快速達到平衡提供了有力保障。

2.5 實際樣品分析

利用高效液相-熒光檢測器分別檢測赭曲霉毒素A標準溶液、用免疫親和柱萃取液和分子印跡固相萃取柱的萃取液，實驗結(jié)果如圖5所示。很明顯自制分子印跡固相萃取柱萃取濾液對應(yīng)的赭曲霉毒素A的信號峰明顯高于免疫親和柱，說明自制柱吸附赭曲霉毒素A的效果比免疫親和柱的效果好。

3 結(jié)論

本文采用片段印跡技術(shù)，以原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法合成分子印跡聚合物。經(jīng)單因素和正交試驗優(yōu)化確定最佳合成條件，合成的聚合物能夠快速吸附溶液中的赭曲霉毒素A，且吸附量很大。將合成的分子印跡聚合物用作填料制備了自制固相萃取柱，與免疫親和柱對比，發(fā)現(xiàn)自制柱萃取效果要優(yōu)于免疫親和柱，相對于免疫親和柱昂貴的價格和苛刻的使用條件，自制固相萃取柱在未來的生產(chǎn)實踐中將會有更好的應(yīng)用前景。