楊華梅， 杭 莉， 刁春霞*， 張雪梅

(泰州市疾病預(yù)防控制中心，江蘇泰州 225300)

草甘膦(Glyp)和草銨膦(Gluf)均為非選擇性、內(nèi)吸附型的轉(zhuǎn)基因作物耐受除草劑，他們的使用量分別位于世界第一和第二的位置[1,2]，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。我國是農(nóng)業(yè)大國，草甘膦、草銨膦的生產(chǎn)和使用量都位居世界前列[3]。草甘膦通過干擾腸道細(xì)菌，抑制CYP酶類，以及影響硫酸鹽的運(yùn)輸活動(dòng)，可增加乳糜瀉、自閉癥譜系障礙、不孕不育癥、肥胖癥以及癌癥等臨床疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)[4]。草銨膦因其可能會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物和非目標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物造成危害，歐盟委員會(huì)已于2013年11月13日開始限制草銨膦除草劑的使用[5]。另外有研究顯示草銨膦會(huì)造成人的DNA氧化性損傷[6]，在使用草銨膦的地區(qū)，通過飲食和飲水可對(duì)人體和動(dòng)物造成危害[7 - 9]。草甘膦在環(huán)境中主要有氨甲基膦酸(AMPA)、N-乙酰氨甲基膦酸(N-Acely-AMPA)，他們具有與有機(jī)膦化合物類似的毒理作用[3]。草銨膦在環(huán)境中主要降解為3-甲基磷酸亞基丙酸(MPPA)。大量使用草甘膦和草銨膦必然會(huì)對(duì)土壤、水體及生物等造成極大的污染，并通過食物鏈的生物富集作用對(duì)人體產(chǎn)生潛在及長期的毒性[10]。因此，對(duì)草甘膦和草胺膦的檢測(cè)具有重要意義。

目前文獻(xiàn)報(bào)道較多的主要關(guān)于水中草甘膦及其氨甲基膦酸的測(cè)定，最常用的檢測(cè)方法有柱后衍生液相色譜法[10,11]、柱前衍生液相色譜法[12,13]、柱前衍生液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用直接測(cè)定法[15]。但草甘膦與草銨膦及其代謝物同時(shí)檢測(cè)的方法報(bào)道很少[12,16]。本文采用超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定水中草甘膦、氨甲基膦酸、乙酰氨甲基膦酸、草銨膦和3-(甲基膦基)丙酸5種化合物。將此方法應(yīng)用到泰州市自來水和河水中此5種物質(zhì)的檢測(cè)中，從而對(duì)泰州河水中草甘膦和草銨膦的富集污染情況有了初步了解。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY超高效液相色譜(美國,Waters公司)；AB SCIEX API4000+質(zhì)譜儀(美國,AB公司)；中佳HC-3018R高速冷凍離心機(jī)。

草甘膦(純度99%)、氨甲基膦酸(純度99%)、草銨膦(純度99%)、3-(甲基膦基)丙酸(純度99%)、乙酰氨甲基膦酸(純度99%)，均購于Sigma公司(美國)。稱取以上各物質(zhì)0.1 g于100 mL容量瓶中，用純水定容，得濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃下保存；混合標(biāo)準(zhǔn)使用液根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用0.1%甲酸水溶液稀釋配制。乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏瓶裝蒸餾水。

1.2 水樣的采集與儲(chǔ)存方法

水樣采集與儲(chǔ)存同國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 5750.9-2006)中的方法。泰州城區(qū)生活飲用水樣品共采集20份，分別為二次供水4份、管網(wǎng)末梢水14份，出廠水4份；泰州城區(qū)內(nèi)河水共43份；泰州城區(qū)周邊農(nóng)村河水13份。

1.3 樣品前處理

將采集的水樣充分混勻后，取1.0 mL于2.5 mL具塞塑料管中，加入1 μL甲酸，混勻，置于高速離心機(jī)中,以20 000 r/min離心10 min，取上清液直接測(cè)定。

1.4 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：SIELC Obelisc N柱(50 mm×2.1 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液+乙腈=99+1，等度洗脫。流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣體積：20.0 μL；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：25 ℃。保留時(shí)間定性，峰面積外標(biāo)法定量。

1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧電離源，負(fù)離子(ESI-)掃描；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；碰撞氣壓力(CAD)：4 Pa；氣簾氣壓力(CUR)：30 Pa；霧化氣壓力(GS1)：65 Pa；輔助氣壓力(GS2)：65 Pa；入口電壓(EP)：10 V；碰撞室出口電壓(CXP)：15 V；噴霧電壓：4 000 V；氣化溫度：350 ℃。定量和定性離子、碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 5種物質(zhì)的保留時(shí)間、相對(duì)分子質(zhì)量和優(yōu)化的質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

草甘膦、氨甲基膦酸、乙酰氨甲基膦酸、草銨膦和3-(甲基膦基)丙酸5種化合物屬于水溶性強(qiáng)極性的弱酸性化合物，在酸性條件下相對(duì)穩(wěn)定，因此在處理水樣時(shí)加入微量甲酸使樣品呈微酸性。

2.2 色譜柱的選擇

考察了Waters Atlantis T3色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和SIELC Obelisc N色譜柱(50 mm×2.1 mm，5 μm)的分離效果。結(jié)果表明：5種化合物在Waters Atlantis T3色譜柱中出峰很快，并且拖尾嚴(yán)重。而SIELC Obelisc N色譜柱具有很好的極性特點(diǎn)，非常適用于極性以及帶電樣品的分離，在上述流動(dòng)相條件下能將5種極性的待測(cè)物分離。故實(shí)驗(yàn)選擇SIELC Obelisc N色譜柱(50 mm×2.1 mm，5 μm)。

圖1 5種標(biāo)準(zhǔn)混合物質(zhì)的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the five mixed standard solution

2.3 流動(dòng)相的選擇

比較了甲醇、甲醇∶0.1%甲酸水(50∶50)、甲醇∶0.1%甲酸水(30∶70)、甲醇∶0.1%甲酸水(1∶99)等幾種流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)甲醇∶0.1%甲酸水(1∶99)能夠很好的分離5種待測(cè)物。在0.2～1.0 mL/min范圍內(nèi)改變流動(dòng)相流速，在0.6 mL/min時(shí)出峰時(shí)間合適，峰形較好。綜合考慮，確定測(cè)定的色譜條件為：流動(dòng)相為甲醇∶0.1%甲酸水(1∶99)，流速0.6 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。各個(gè)待測(cè)物的MRM色譜圖如圖1所示。

2.4 線性關(guān)系

5種待測(cè)物儲(chǔ)備溶液用0.1%甲酸水溶液稀釋配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，然后再稀釋成濃度為1、2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列。以上述色譜-質(zhì)譜條件，對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析，采用多點(diǎn)線性校正，建立峰面積-待測(cè)物濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍噪音為樣品檢出限。本方法5種物質(zhì)的回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2。

表2 5種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LOD)

2.5 回收率、精密度和檢出限

在處理的水樣中添加標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，制備20、50、150 ng/mL 3個(gè)濃度加標(biāo)水平的樣品，每個(gè)濃度水平設(shè)6個(gè)平行樣品。用本方法進(jìn)行測(cè)定，平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

表3 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.6 方法的應(yīng)用

用本方法分別對(duì)泰州市生活飲用水20份、城區(qū)河水共43份和周邊農(nóng)村河水13份樣進(jìn)行檢測(cè)。其中生活飲用水中5種化合物均為檢出；城區(qū)河水中草甘膦和氨甲基膦酸檢出率分別為74.4%和72.1%，濃度范圍分別為0.36～0.59 μg/L和0.15～7.23 μg/L，其余3種物質(zhì)均未檢出；周邊農(nóng)村河水中草甘膦和氨甲基膦酸檢出率分別為15.4%和76.9%，濃度范圍分別為0.43～0.50 μg/L和0.30～1.60 μg/L，其余3種物質(zhì)均未檢出。部分樣品色譜見圖2和圖3。生活飲用水中草甘膦和其代謝物沒有檢出可能是飲用水中余氯對(duì)草甘膦的分解有較大影響[17]。

圖2 樣品中氨甲基膦酸的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of AMPA in the sample

圖3 樣品中草甘膦的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of Glyp in the sample

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水樣中草甘膦、氨甲基膦酸、乙酰氨甲基膦酸、草銨膦和3-(甲基膦基)丙酸5種化合物。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于水中草甘膦、氨甲基膦酸、乙酰氨甲基膦酸、草銨膦和3-(甲基膦基)丙酸的殘留檢測(cè)。通過對(duì)泰州市生活飲用水和河水中5種有機(jī)膦農(nóng)藥及其代謝物的檢測(cè)，大致了解了泰州市生活飲用水和河水中有機(jī)膦農(nóng)藥及其代謝物的污染情況。城區(qū)河水中草甘膦代謝物檢出率比周邊農(nóng)村河水高可能是城區(qū)河水的流動(dòng)性差導(dǎo)致的。由于采集樣品數(shù)量有限，故結(jié)果不足以說明泰州河水中草甘膦污染的整體趨勢(shì)，不過從另一方面可以推斷，泰州河水正經(jīng)受著一定程度上草甘膦的污染，這種情況與近年來對(duì)除草劑草甘膦的大量使用有著一定的關(guān)系。