周 行， 肖 雷， 楊小芳， 張書(shū)飛， 王慶飛*， 崔榮靜*

(1.河北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，河北石家莊 050024；2.常熟理工學(xué)院江蘇省新型功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇常熟 215500)

多巴胺(DA)是一種由腦內(nèi)分泌的神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，其水平異常可能導(dǎo)致多種疾病，如精神分裂癥、亨廷頓舞蹈癥、帕金森病和癡呆等[1]。因此，多巴胺的測(cè)定已成為生物醫(yī)學(xué)化學(xué)、神經(jīng)化學(xué)以及診斷病理學(xué)研究等領(lǐng)域的重要課題[2]。目前用于多巴胺的測(cè)定包括高效液相色譜法[3]、質(zhì)譜法[4]、分光光度法[5]及電化學(xué)法[6]等檢測(cè)方法。與上述傳統(tǒng)的分析方法相比，多巴胺的電化學(xué)測(cè)定因其靈敏度高、成本低和電流響應(yīng)較快而備受科研工作者的關(guān)注[7]。在電化學(xué)分析中，修飾電極對(duì)多巴胺[8]的敏感和選擇性檢測(cè)起著重要作用。

納米多孔金屬材料因其制備方法相對(duì)簡(jiǎn)單、所制得的材料性能良好而備受關(guān)注，如：因納米多孔金屬材料的孔洞結(jié)構(gòu)而具有較大的比表面積，可以為電化學(xué)中的氧化還原反應(yīng)提供更多的催化活性位點(diǎn)；因納米多孔金屬材料的雙聯(lián)通結(jié)構(gòu)而具有較廣闊的電子運(yùn)輸通道，可以為反應(yīng)中氧化還原反應(yīng)中電子的得與失而提供有效的傳遞渠道。在納米多孔金屬材料體系中，Ni、Pt等金屬元素因其具有獨(dú)特的性能而被廣泛應(yīng)用。石墨烯(GR)是一種單原子層的二維碳材料，具有高的比表面積和電子轉(zhuǎn)移速率[9]，因其本身具有催化活性而被用作催化劑載體做電極修飾材料。本文主要是通過(guò)電弧熔煉、熔體快淬和脫合金技術(shù)制得納米多孔鎳(NP-Ni)，然后將其置于0.8 mmol/L的H2PtCl6溶液中攪拌，致使Pt通過(guò)置換反應(yīng)，從而制得納米多孔鎳鉑(NP-NiPt)。最后將所制備的NP-NiPt與GR復(fù)合制得NP-NiPt/GR復(fù)合材料，用于修飾玻碳電極(GCE)，從而成功構(gòu)建NP-NiPt/GR/GCE電化學(xué)傳感器用于多巴胺檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；GDJ500C電弧熔煉及單旋系統(tǒng)(沈陽(yáng)科友真空技術(shù)有限公司)；EVO18掃描電鏡(德國(guó)，ZEISS公司)；Tecnai G220S -TWIN透射電鏡(美國(guó)，F(xiàn)EI公司)；SA-HF3 X射線粉末衍射儀(日本，Rigaku公司)。

Ni、Mn(99.99%，吉林東北有色金屬有限公司)；聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA，20.0%)、Nafion(0.5%)(Sigma-Aldrich公司)；石墨烯(GR，南京先豐納米材料科技有限公司)；多巴胺(DA)、尿酸(UA)和抗壞血酸(AA)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；(NH4)2SO4(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；H2PtCl6(分析純，上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司)；Na2HPO4、NaH2PO4(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；N2(99.99%，常熟市琴湖工業(yè)氣體廠)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

血清樣品為常熟市第一人民醫(yī)院提供。

1.2 NP-NiPt材料的制備

納米多孔金屬材料前驅(qū)體合金為Ni30Mn70。稱(chēng)取適量用電弧熔煉與熔體快淬方法制備N(xiāo)i30Mn70合金條帶，在管式爐中800 ℃下退火24 h，再將其置于1 mol/L (NH4)2SO4溶液中在50 ℃水浴鍋下腐蝕48 h，用超純水和乙醇洗滌4～5次，最后將材料置于真空干燥箱(45 ℃)中干燥24 h后研磨成粉，即可制得納米多孔鎳NP-Ni催化劑。

稱(chēng)取8 mg NP-Ni材料，再加入120 mL 0.8 mmol/L的H2PtCl6溶液，置于溫度5 ℃和N2保護(hù)下持續(xù)攪拌1 h，使兩個(gè)材料充分接觸，以使Pt通過(guò)置換反應(yīng)負(fù)載到NP-Ni材料的表面，制得NP-NiPt材料。最后用超純水清洗材料數(shù)次并真空干燥24 h，備用。

1.3 修飾電極的制備

稱(chēng)取2 mg NP-NiPt與400 μL石墨烯(GR)溶液(用0.2%的PDDA分散處理)混合，然后超聲1 h使溶液完全混合均勻，得到電極修飾材料NP-NiPt/GR的濃度為5 mg/mL。

將玻碳電極(GCE)在麂皮上用Al2O3粉末打磨拋光，用超純水沖洗后，依次在乙醇和超純水中超聲清洗10 min。用超純水充分沖洗，干燥后備用。首先取4 μL的NP-NiPt/GR涂滴于晾干的GCE上。待材料晾干后，取2 μL 0.5%Nafion溶液滴于材料之上，晾干即可得到NP-NiPt/GR/GCE。

1.4 電化學(xué)測(cè)試

電化學(xué)測(cè)試前往溶液里通入高純N210 min除氧，所有測(cè)試過(guò)程均保持在25 ℃、N2氣氛下進(jìn)行測(cè)試。并在不同pH值的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的電化學(xué)電解池中進(jìn)行循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 NP-NiPt的掃描電鏡和透射電鏡表征

從圖1(A)的掃描電鏡(SEM)圖中可以看出，NP-Ni表面有星星點(diǎn)點(diǎn)的白色材料附著在上面，那就是通過(guò)簡(jiǎn)單的置換所負(fù)載上的Pt。圖1(B)為高倍率下清楚的看到NP-NiPt材料表面的小孔洞，密密麻麻分布其中，為電化學(xué)反應(yīng)提供更多的電子運(yùn)輸通道、比表面積和電催化活性位點(diǎn)。

圖1 NP-NiPt低倍(A)和高倍(B)內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡(SEM)圖像Fig.1 SEM images of low(A)and high(B)internal microstructure of the NP-NiPt

通過(guò)透射電鏡(TEM)進(jìn)一步觀察NP-NiPt材料的內(nèi)部晶格條紋結(jié)構(gòu)。圖2(A)中明暗相間的形貌說(shuō)明所制備的NP-NiPt材料為多孔結(jié)構(gòu)，與前面SEM圖中所表達(dá)的形貌一致。而從2(B)圖中可以清楚地看到均勻分布的晶格條紋，晶格間距分別為0.212 nm和0.219 nm，其分別對(duì)應(yīng)于X射線衍射(XRD)圖譜中的(111)晶面。說(shuō)明所制備的NP-NiPt材料擁有較均勻的多孔形貌結(jié)構(gòu)，為接下來(lái)的多巴胺檢測(cè)提供了催化劑材料。

圖2 NP-NiPt的透射電鏡(TEM)(A)和高分辨透射電鏡(HRTEM)(B)圖像Fig.2 TEM image(A) and HRTEM image (B) of the NP-NiPt

2.2 NP-NiPt的X射線衍射和能譜分析

圖3 NP-NiPt粉末的X射線衍射(XRD)(A)和能譜(EDS)(B)譜圖(：Ni；*：Pt)Fig.3 XRD patterns (A)and EDS(B) of NP-NiPt powders(:Ni;*:Pt)

2.3 不同修飾電極的電化學(xué)行為

圖4 裸GCE(a)、NP-Ni/GCE(b)、GR/GCE(c)、NP-NiPt/GCE(d)和NP-NiPt/GR/GCE(e)在含有0.1 mmol/L DA的PBS(pH=7.0)中的循環(huán)伏安(CV)圖Fig.4 CVs of bare GCE(a),NP-Ni/GCE(b),GR/GCE(c),NP-NiPt/GCE(d),and NP-NiPt/GR/GCE(e)in phosphate buffer solution(pH=7.0)containing 0.1 mmol/L DA

通過(guò)循環(huán)伏安(CV)法探究了在0.1 mol/L的PBS(pH=7.0) 中檢測(cè)多巴胺在不同修飾電極上的電流響應(yīng)。圖4分別顯示了含有0.1 mmol/L多巴胺的裸GCE(a)、NP-Ni/GCE(b)、GR/GCE(c)、NP-NiPt/GCE(d)和NP-NiPt/GR/GCE(e)的電流響應(yīng)，可以看出各修飾電極對(duì)多巴胺的催化作用不同。從圖上可以看出多巴胺在NP-NiPt/GCE(d)上的電流響應(yīng)與NP-Ni/GCE(b)相比有顯著增強(qiáng)。第一是由于NP-NiPt材料表面的小孔洞，為反應(yīng)提供更大的比表面積、更多的電子運(yùn)輸通道和電催化活性位點(diǎn)。第二是由于納米Pt具有較高的電催化活性。與其他電極相比，多巴胺在NP-NiPt/GR/GCE(e)上的伏安響應(yīng)值最大，顯示了清晰的氧化還原過(guò)程，這主要?dú)w功于石墨烯和NP-NiPt材料具有較大的比表面積和導(dǎo)電性能，以及NP-NiPt和石墨烯的協(xié)同作用，提高了修飾電極的催化能力。因而，NP-NiPt/GR/GCE電化學(xué)生物傳感器對(duì)多巴胺的檢測(cè)具有良好的催化活性。

2.4 底液酸度的影響

利用CV法在NP-NiPt/GR/GCE修飾電極上，在不同pH(4.0～9.0)的PBS中對(duì)多巴胺進(jìn)行CV分析。由圖5(A)知，NP-NiPt/GR/GCE上多巴胺的氧化還原電流響應(yīng)隨pH的改變而改變，其氧化還原峰峰電位隨著pH值增大均向負(fù)電位方向移動(dòng)，說(shuō)明質(zhì)子參與了該化學(xué)反應(yīng)。圖5(B)則描述了該反應(yīng)過(guò)程中pH值和氧化峰、還原峰值電流之間的關(guān)系，可以明顯的看到多巴胺的氧化峰、還原峰電流值隨著pH從4.0增加到7.0，在pH=7.0處氧化峰、還原峰電流強(qiáng)度都到達(dá)其最大值，然后顯著降低。所以，選擇pH=7.0的0.1 mol/L PBS作為以下實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的最佳電解質(zhì)溶液。圖5(C)是溶液pH值與多巴胺的氧化峰電位(Epa)、還原峰電位(Epc)具有良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程分別為：Epa(V)=-0.031pH+0.406(R2=0.992)，Epc(V)=-0.024pH+0.165(R2=0.994)。

圖5 NP-NiPt/GR/GCE在不同pH的PBS(4.0～9.0)中對(duì)DA的CV圖(A)。pH對(duì)氧化還原(Ipa、Ipc)電流(B)和氧化還原(Epa、Epc)電位(C)的影響Fig.5 CVs of NP-NiPt/GR/GCE in different pH PBS (4.0～9.0) of DA(A).Effect of pH on Ipa and Ipc current(B)and Epa and Epc potential(C)

2.5 掃描速率的影響

圖6(A)是不同掃速下的CV圖。由圖可以看出多巴胺的氧化還原峰峰電流強(qiáng)度隨著掃速的逐漸增加而增加，且其氧化還原電位(Epa和Epc)亦略有變化。圖6(B)、6(C)為掃速與氧化還原峰值電流、電位的線性關(guān)系擬合圖。由圖可知，在50～500 mV/s的線性掃描范圍內(nèi)，NP-NiPt/GR/GCE上多巴胺的氧化峰電流(Ipa)、還原峰電流(Ipc)與掃速(v)成線性關(guān)系，其線性回歸方程分別為：Ipa(μA)=0.081v(mV/s)+19.372(R2=0.991)，Ipc(μA)=-0.142v(mV/s)-20.789(R2=0.990)；NP-NiPt/GR/GCE上多巴胺的氧化(Epa)、還原(Ipc)峰值電位與掃速(v)成線性關(guān)系，其線性方程可分別表示為：Epa(μA)=1.7757×10-4v(mV/s)+0.086(R2=0.993)，Epc(μA)=-2.0009×10-4v(mV/s)+0.165(R2=0.992)。由此可知，NP-NiPt/GR/GCE修飾電極催化多巴胺的氧化還原反應(yīng)為吸附控制過(guò)程。

圖6 NP-NiPt/GR/GCE在PBS(pH=7.0)中對(duì)DA檢測(cè)中不同掃速(a～k：50～500 mV/s)的CV圖(A)。掃速對(duì)氧化還原(Ipa、Ipc)電流(B)和氧化還原(Epa、Epc)電位(C)的影響Fig.6 CVs of DA in phosphate buffer solution(pH=7.0) at NP-NiPt/GR/GCE with different scan rates (a - k:50 - 500 mV/s)(A).Effect of sacn rate on Ipa and Ipc current(B)and Epa and Epc potential(C)

2.6 線性范圍與檢出限

構(gòu)建的NP-NiPt/GR/GCE電化學(xué)傳感器運(yùn)用差分脈沖伏安(DPV)技術(shù)對(duì)多巴胺進(jìn)行定量檢測(cè)，圖7(A)為多巴胺的DPV響應(yīng)曲線。由圖可見(jiàn)，隨著多巴胺濃度的不斷增加，多巴胺的峰值電流隨之增加；其插圖為濃度從0.5～25 μmol/L的DPV響應(yīng)曲線，可以很清晰的看到當(dāng)多巴胺濃度僅為0.5 μmol/L時(shí)，就已出現(xiàn)氧化峰，說(shuō)明該傳感器的檢出限較低。圖7(B)顯示其回歸曲線在低濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較寬的線性濃度范圍：0.5～300 μmol/L，其線性回歸方程表示為：Ipa(μA)=0.106c(μmol/L)+0.541(R2=0.993)，檢出限(S/N=3)為0.41 μmol/L。NP-NiPt/GR/GCE電化學(xué)傳感器與其他檢測(cè)多巴胺的方法的比較如表1所示。通過(guò)對(duì)比，可以表明實(shí)驗(yàn)中的NP-NiPt/GR/GCE電化學(xué)生物傳感器相對(duì)于其他方法具有較寬的線性濃度檢測(cè)范圍和較低的檢出限。

圖7 (A)NP-NiPt/GR/GCE在PBS(pH=7.0)中對(duì)不同濃度(a～q：0.5～300 μmol/L)DA的DPV響應(yīng)(插圖：濃度從0.5～25 μmol/L的DPV響應(yīng))；(B)DA的校正曲線Fig.7 (A)DPVs response for the different concentration(a - q:0.5 - 300 μmol/L)of DA at NP-NiPt/GR/GCE in PBS(pH=7.0)(Inset:DPVs response concentration ranging from 0.5 - 25 μmol/L)；(B) Calibration curve for DA

表1 各種修飾電極對(duì)多巴胺檢測(cè)的比較

2.7 重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及選擇性研究

為了研究構(gòu)建的NP-NiPt/GR/GCE傳感器的重現(xiàn)性，在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，用同一支修飾電極連續(xù)測(cè)定0.1 mmol/L多巴胺9次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤2.75%。用不同批次的9根修飾電極測(cè)定0.1 mmol/L多巴胺，其RSD≤3.05%。當(dāng)NP-NiPt/GR/GCE修飾電極在4 ℃冰箱中保存超過(guò)15 d，多巴胺的電流響應(yīng)信號(hào)相對(duì)于初始信號(hào)的下降幅度小于3.30%。結(jié)果表明NP-NiPt/GR/GCE對(duì)多巴胺的檢測(cè)具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

實(shí)驗(yàn)中同時(shí)對(duì)100倍的KCl、NaCl、葡萄糖、抗壞血酸和尿酸等共存物質(zhì)的干擾進(jìn)行了檢測(cè)，多巴胺的峰值電流略有變化(小于2.0%)?？箟难?、尿酸的電化學(xué)氧化對(duì)DA的電流響應(yīng)影響也不大(小于7.0%)。這些表明所構(gòu)建的NP-NiPt/GR/GCE電化學(xué)生物傳感器具有良好的選擇性和穩(wěn)定性。我們推測(cè)，一是因?yàn)閭鞲衅魇褂昧溯^高催化性能的電極材料，二是因?yàn)樵谛揎楇姌O過(guò)程中，Nafion膜的使用可以對(duì)電極上的修飾材料起到保護(hù)作用，使得電極不受污染，同時(shí)防止材料脫落；另外Nafion膜使電極與溶液分開(kāi)，某些離子可以透過(guò)膜到達(dá)電極表面進(jìn)行反應(yīng)，而有些離子就被隔在膜外，從而使測(cè)定的選擇性得到提高。

2.8 實(shí)際樣品分析

用DPV法對(duì)人體血清樣品中的多巴胺進(jìn)行了直接分析，探討了NP-NiPt/GR/GCE電化學(xué)傳感器在實(shí)際樣品分析中的應(yīng)用。血清樣本在測(cè)量前用PBS(pH=7.0)稀釋100倍，未進(jìn)行其他預(yù)處理。經(jīng)計(jì)算，該方法的回收率范圍為99%～102%，RSD小于4.0%。說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)條件下，構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器可用于實(shí)際樣品中多巴胺的測(cè)定。

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了具有高催化性能的NP-NiPt/GR/GCE電化學(xué)生物傳感器，用于檢測(cè)生物小分子多巴胺。該電化學(xué)生物傳感器對(duì)多巴胺具有優(yōu)異的電催化活性，對(duì)多巴胺檢測(cè)的線性濃度檢測(cè)范圍為0.5～300 μmol/L(R2=0.993)，檢出限為0.41 μmol/L。