彭翠英， 梁軍生， 蒲湘云， 袁 果， 王旭軍

(1.湖南省林業(yè)科學院， 湖南 長沙 410004；2.湖南省林下特色生物資源培育與利用工程技術研究中心， 湖南 長沙 410004；3.常德市袁果中藥材種植專業(yè)合作社， 湖南 安鄉(xiāng) 415604)

半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit 為天南星科 Araceae 半夏屬Pinellia多年生草本植物，喜溫暖潮濕，耐蔭蔽，廣布于我國海拔2 500 m以下的草坡、荒地、田邊或疏林下(內蒙古、新疆、青海和西藏等地除外)[1]。其干燥塊莖即為著名傳統(tǒng)大宗中藥材半夏PinelliaeRhizoma，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品，具燥濕化痰、降逆止嘔和消痞散結等功效[2-3]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，半夏在抗腫瘤[4]、抗生育[5]、降血脂[6]和治療冠心病[7]等方面的應用潛力也巨大。因此，半夏一直以來受到眾多醫(yī)藥工作者的青睞，市場年需求量約5 500 t[8]。為滿足市場需求，半夏野生資源被過度采挖，加之農(nóng)田生態(tài)環(huán)境改變，部分地區(qū)半夏野生資源已瀕臨滅絕。目前栽培半夏的種球未經(jīng)遺傳選擇，或自繁自育，導致半夏藥材質量良莠不齊。因此，半夏種質資源收集、評價及良種選育等亟待開展?！八幉暮?，藥才好”。種質資源的優(yōu)劣對中藥材的質量有著決定性的意義。種質資源的多樣性不僅是優(yōu)質藥材形成的基礎，更對中藥材的良種選育有著極其重要的意義。研究結果表明，不同種源半夏不僅在出苗、展葉、抽薹及倒苗期等生長節(jié)律方面存在著差異[9]，在單株產(chǎn)量以及鳥苷和總生物堿含量等經(jīng)濟性狀方面也存在顯著甚至極顯著的差異[10]。但這種差異是由環(huán)境因素引起的，還是由遺傳差異導致的，目前尚未見相應研究的報道。因此，本文以16個半夏野生種源為材料，研究其總有機酸、生物堿和鳥苷等藥用有效成分含量在種源水平上的地理變異和遺傳變異規(guī)律等，以期為半夏良種選育和標準化栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為2018年8月采集于永定區(qū)、中方縣等16個產(chǎn)地的野生半夏(具體見表1)，每個種源采集鮮半夏5 kg，經(jīng)去皮、洗凈和曬干處理后研成粉末，過60目篩，然后 于60 ℃恒溫烘干至恒質量后用于藥用有效成分含量測定。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗方法 半夏的總有機酸含量按電位滴定法測定[3]；生物堿含量按分光光度法測定[10]；鳥苷含量按反向高效液相色譜法(HPLC)測定[10]。各3次重復。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)首先用WPS 2019 處理，再用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行方差分析、相關分析和聚類分析等。各遺傳參數(shù)的計算和隸屬函數(shù)法分析則分別參照文獻[11]和[12]進行。

表1 半夏種源地理氣候因子Tab.1 The geographical and climatic factors of Pinellia ternata of different provenance 序號種源地經(jīng)度/°E緯度/°N海拔/m年均溫/℃年降水量/mm無霜期/d1月均溫/℃7月均溫/℃≥10 ℃積溫/℃1永定區(qū)110.50 29.0172616.8 1 497 2705.128.0 5 400 2中方縣109.9527.44 22916.9 1 378 2975.327.9 5 470 3溆浦縣110.74 28.07 26816.9 1 539 2864.428.3 5 277 4新化縣111.34 27.65 30316.8 1 454 2815.128.8 5 300 5沅陵縣110.51 28.46 30716.6 1 441 2724.727.8 5 231 6酉陽縣108.77 28.84 71814.9 1 332 2723.824.5 5 467 7龍山縣109.29 28.78 25215.8 1 308 2854.726.4 5 023 8咸豐縣109.49 30.2749015.7 1 455 2823.029.3 5 091 9古丈縣110.47 28.55 24716.0 1 476 2764.627.0 4 997 10黎平縣109.14 26.23 56915.6 1 322 2884.525.0 4 757 11辰溪縣110.2127.84 43017.4 1 389 2935.128.1 5 389 12桃江縣111.89 28.61 10316.5 1 700 2634.428.6 5 272 13麻陽縣109.62 27.71 21217.2 1 255 2845.323.6 5 375 14吉首市109.70 28.25 20116.7 1 400 2855.426.5 5 177 15安化縣111.72 28.24 40316.2 1 706 2474.328.0 5 263 16永順縣110.11 29.04 48616.4 1 357 2864.529.2 5 196

2 結果與分析

2.1 不同種源半夏的總有機酸含量比較

半夏的總有機酸具有止咳、祛痰及抑制體外腫瘤細胞的作用，為半夏藥理作用的有效成分之一[13]。總有機酸含量越高，其止咳作用越強[14]。由表2可以看出：永定區(qū)種源半夏的總有機酸含量最低，為0.310%；所有種源半夏的總有機酸含量總均值為0.408%，全部種源半夏的總有機酸含量均高于《中國藥典》的0.25%的標準，且所有種源半夏總有機酸含量的總變異系數(shù)僅為8.07%。這說明湖南省各地的半夏品質均優(yōu)良，均可以作為藥材供應市場，且種源間半夏的總有機酸含量變化幅度較小。但方差分析結果又表明，半夏的總有機酸含量在種源間的差異達極顯著(見表2)。這又說明總有機酸含量在半夏種源間變異豐富，優(yōu)良種源的選擇潛力較大。

沅陵縣種源半夏的總有機酸含量最高，達0.437%，且其變異系數(shù)僅為1.32%；其次為新化縣、酉陽縣、麻陽縣等種源，其總有機酸含量均為0.433%，但其與沅陵縣種源的差異未達到顯著水平；總有機酸含量較低的為永順縣和永定區(qū)種源，其中永定區(qū)種源的總有機酸含量僅為沅陵縣種源的70.94%，且其變異系數(shù)達到11.63%。這說明，相對其他種源，永定區(qū)的半夏的總有機酸含量相對較低，且變異幅度較大。

表2 不同種源半夏的藥用有效成分含量比較Tab.2 Comparison of medicinal active ingredient content of Pinellia ternata among different provenances %種源總有機酸生物堿鳥苷均值CV均值CV均值CV永定區(qū)0.310 Bc11.630.010 3 Bcd47.410.076 2 ABab7.12中方縣0.413 Aab7.780.018 9 Bbc21.150.033 9 EFg8.39溆浦縣0.417 Aab2.770.032 5 Aa52.130.059 7 CDef6.73新化縣0.433 Aab5.810.034 5 Aa4.270.059 0 CDef6.81沅陵縣0.437 Aa1.320.010 2 Bcd5.270.070 0 ABCabcd6.71酉陽縣0.433 Aab2.660.018 2 Bbc2.330.065 8 BCDcde2.00龍山縣0.410 Aab6.450.013 8 Bbcd13.100.040 9 Eg13.31咸豐縣0.403 Aab2.860.021 2 Bb13.850.069 8 ABCbcd2.68古丈縣0.400 Aab0.000.017 3 Bbcd23.670.054 6 Df13.77黎平縣0.407 Aab3.760.014 3 Bbcd5.300.025 2 Fh17.76辰溪縣0.410 Aab4.220.013 2 Bbcd24.900.070 9 ABCabc17.90桃江縣0.400 Aab2.500.013 8 Bbcd15.180.061 6 CDdef2.85麻陽縣0.433 Aab4.800.008 8 Bd21.970.074 0 ABabc2.65吉首市0.417 Aab7.330.020 0 Bbc11.360.079 1 Aa4.37安化縣0.410 Aab2.440.010 2 Bcd18.950.053 9 Df2.10永順縣0.397 Ab1.460.019 8 Bbc6.550.075 1 ABab1.13總均值0.4088.070.017 348.250.060 626.30F值6.669**6.582**30.914** 注:同一列中不同大、小寫字母分別代表在0.01和0.05水平差異顯著;**代表差異極顯著(P<0.01)。

2.2 不同種源半夏的生物堿含量比較

生物堿為半夏藥理活性的主要物質，具有止嘔、鎮(zhèn)咳、祛痰、降壓、降脂等作用，以及抗腫瘤和增強記憶力之功效，其含量高低直接影響半夏藥材的質量與療效[15-16]。由表2看出，半夏的生物堿含量在種源間的差異也達到極顯著水平，且其變異系數(shù)高達48.25%。半夏的生物堿含量在種源間的變異比總有機酸的大，因此，選育出生物堿含量高的半夏種源的可能性更大。

新化縣和溆浦縣種源半夏的生物堿含量較高，分別為0.345%和0.325%，且兩者間沒有顯著性差異。溆浦縣種源半夏生物堿含量的變異系數(shù)高達52.13%，遠遠高于新化縣種源的(4.27%)。這說明新化縣種源的生物堿含量高且穩(wěn)定，而溆浦縣種源的則變化幅度較大。其他種源生物堿含量與前兩者的差異均達到極顯著水平，特別是含量最低的麻陽縣種源，其生物堿含量為0.0088%，約為新化縣種源的1/4。

2.3 不同種源半夏的鳥苷含量比較

鳥苷也是半夏藥理作用的主要有效成分，具有抗腫瘤、抗病毒、基因治療等多種功效[17]。由表2看出：半夏的鳥苷含量在種源間差異極顯著。其中，吉首市種源的鳥苷含量最高，為0.0791%，且其變異系數(shù)也僅為4.37%；其次為永定區(qū)、永順縣、麻陽縣、辰溪縣等種源的，但與吉首市種源的差異未達到顯著水平。黎平縣種源半夏的鳥苷含量最低，為0.0252%，僅為吉首市種源的31.86%，且其變異系數(shù)高達17.76%。

2.4 半夏藥用有效成分含量的相關性

由表3看出，半夏的總有機酸含量與生物堿含量呈正相關，與鳥苷含量呈負相關，生物堿含量與鳥苷含量也呈負相關，但均未達到顯著相關水平。這意味著半夏的總有機酸、生物堿和鳥苷含量所受控的基因組間連鎖不密切，可以進行獨立選擇，也意味著選育出總有機酸、生物堿和鳥苷含量都高的半夏種源是很有可能的。

表3 半夏藥用有效成分含量的相關性Tab.3 Correlation analysis of medicinal active ingredient content of Pinellia ternata成分 生物堿鳥苷總有機酸0.261 -0.035 生物堿-0.141

2.5 半夏藥用有效成分含量與環(huán)境氣候因子的相關性

由表4可以看出：半夏的總有機酸含量除與無霜期呈微弱正相關外，與經(jīng)度、緯度以及海拔、年均溫、1月均溫等環(huán)境氣候因子均呈微弱負相關。半夏的生物堿含量與經(jīng)度、年均溫、年降水量、無霜期、7月均溫以及≥10 ℃積溫均呈微弱正相關，與緯度、海拔、1月均溫均呈微弱負相關。這意味著半夏的總有機酸和生物堿含量均可能與溫度關系比較密切，溫度越高，其總有機酸含量可能越低，而總生物堿含量卻可能越高。半夏的鳥苷含量除與無霜期呈微弱負相關外，與經(jīng)度、緯度等其他環(huán)境氣候因子均呈正相關，特別是與緯度達到顯著正相關水平。這說明半夏的鳥苷含量呈現(xiàn)比較明顯的緯向變異，越靠北的種源，其鳥苷含量也可能越高。

表4 半夏藥用有效成分含量與環(huán)境氣候因子的相關性Tab.4 Correlation analysis of medicinal active ingredient content and geographical factors of Pinellia ternata成分經(jīng)度緯度海拔年均溫年降水量無霜期1月均溫7月均溫≥10 ℃積溫總有機酸-0.134-0.281-0.441-0.084-0.2430.169-0.061-0.283-0.010生物堿0.125-0.006-0.1350.0290.0560.320-0.1270.3720.026鳥苷0.1190.565*0.1010.3210.070-0.1730.0130.1720.450 注:*代表在0.05水平上顯著相關。

2.6 不同種源半夏的藥用有效成分含量遺傳變異

由表5可以看出，半夏的總有機酸、生物堿含量的遺傳方差均小于其環(huán)境方差，而鳥苷的卻剛好相反。這說明半夏的總有機酸和生物堿含量在種源水平上的變異程度受環(huán)境的影響比較大，而鳥苷含量的變異程度受環(huán)境的影響較小，能比較穩(wěn)定地遺傳。此外，半夏的總有機酸、生物堿和鳥苷含量在種源水平上的廣義遺傳力分別為0.2712、0.2743和0.6660(見表5)。這進一步說明半夏的總有機酸、生物堿含量在種源間的變異主要受環(huán)境影響，而鳥苷含量則受到中等強度以上的遺傳控制，主要來源于種源自身的遺傳特性。因此，以鳥苷含量為指標來進行半夏優(yōu)良種源的選擇是比較可靠的。

表5 不同種源半夏的藥用有效成分含量遺傳參數(shù)Tab.5 Genetic variation parameter of medicinal active ingredient content of Pinellia ternata of different provenances 成分遺傳方差環(huán)境方差表型方差廣義遺傳力遺傳變異系數(shù)/%環(huán)境變異系數(shù)/%總有機酸0.000 14 0.000 39 0.000 53 0.271 21 0.035 52 0.095 46 生物堿0.000 93 0.002 45 0.003 38 0.274 29 0.535 29 1.416 25 鳥苷0.000 05 0.000 02 0.000 07 0.666 03 0.079 25 0.039 74

遺傳變異系數(shù)是衡量群體性狀遺傳變異潛力的重要參數(shù)。遺傳變異系數(shù)越大，說明該群體性狀的遺傳潛力越大[18]。由表5看出，半夏的總有機酸、生物堿和鳥苷含量在種源水平上的遺傳變異系數(shù)都比較小，這說明半夏優(yōu)良種源選擇的遺傳潛力比較小，半夏良種選育可能更應重視種源內優(yōu)良單株的選育。由表5還可以看出，半夏的總有機酸和生物堿含量的環(huán)境變異系數(shù)均大于其遺傳變異系數(shù)，這說明栽培措施的改善可適度提高半夏的總有機酸和生物堿含量。

2.7 半夏不同種源聚類分析

廣布種植物的地理變異模式有連續(xù)變異、區(qū)域板塊變異以及隨機變異等模式[19]。以總有機酸、生物堿和鳥苷含量為指標，采用平方Euclidean(歐式)距離，用離差平方和法進行系統(tǒng)聚類，建立聚類樹狀圖(圖1)。由圖1可以看出，在遺傳距離為5時，將16個半夏種源聚為4類：第1類為龍山縣、黎平縣、辰溪縣、桃江縣、沅陵縣、麻陽縣和安化縣共7個種源，第2類為恩施縣、永順縣、吉首市、中方縣、古丈縣和酉陽縣共6個種源。第3類為永定區(qū)種源單獨聚成1類，第4類為溆浦縣和新化縣種源2個種源。由以上聚類結果可以看出，既存在地理分布相近的種源如溆浦縣和新化縣種源聚為一類的現(xiàn)象，也存在地理分布相隔較遠種源如龍山縣、黎平縣、桃江縣和辰溪縣等種源聚為一類的現(xiàn)象。這說明半夏種源存在隨機變異、區(qū)域板塊變異等地理變異模式。

2.8 半夏不同種源綜合評價

半夏的藥用有效成分種類多且復雜，主要含有機酸、生物堿、半夏蛋白、揮發(fā)油、氨基酸、淀粉等[20]，僅以總有機酸這一個指標遠不能完全代表半夏的整體質量，更不能完全反映其臨床療效。因此，本文以總有機酸、生物堿和鳥苷含量為指標，運用隸屬函數(shù)法綜合評價不同半夏種源。綜合隸屬度值越大，說明該種源的品質綜合評價越好。根據(jù)綜合隸屬度值的排名位次，篩選出新化縣、溆浦縣、吉首市、永順縣、酉陽縣和咸豐縣共6個表現(xiàn)較優(yōu)的半夏種源。

表6 半夏的不同種源隸屬度分析Tab.6 Analysis on membership function method of Pinellia ternata of different provenances 種源總有機酸生物堿鳥苷綜合隸屬度排序永定區(qū)0.000 0 0.058 4 0.946 2 1.004 6 15中方縣0.811 0 0.393 0 0.161 4 1.365 4 13溆浦縣0.842 5 0.922 2 0.640 1 2.404 8 2新化縣0.968 5 1.000 0 0.627 1 2.595 6 1沅陵縣1.000 0 0.054 5 0.831 2 1.885 6 7酉陽縣0.968 5 0.365 8 0.753 2 2.087 5 4龍山縣0.787 4 0.194 6 0.291 3 1.273 2 14咸豐縣0.732 3 0.482 5 0.827 5 2.042 2 5古丈縣0.708 7 0.330 7 0.545 5 1.584 9 10黎平縣0.763 8 0.214 0 0.000 0 0.977 8 16辰溪縣0.787 4 0.171 2 0.847 9 1.806 5 9桃江縣0.708 7 0.194 6 0.675 3 1.578 5 11麻陽縣0.968 5 0.000 0 0.905 4 1.873 9 8吉首市0.842 5 0.435 8 1.000 0 2.278 3 3安化縣0.787 4 0.054 5 0.532 5 1.374 3 12永順縣0.685 0 0.428 0 0.925 8 2.038 8 6

3 結論與討論

不同種源黃岑不僅在種子千粒質量、發(fā)芽率和發(fā)芽勢等方面存在差異[21]，在黃芩苷和黃芩素等藥用有效成分含量方面也具有顯著或極顯著差異[22]。藍云龍的研究也表明，不同種源魚腥草的甲基正壬酮、黃酮類成分含量及產(chǎn)量的差異均達顯著[23]；何首烏二苯乙烯苷類、游離蒽醌類、結合蒽醌類等活性成分含量在魚腥草種源間也存在顯著差異[24]。藥用植物生長量和藥用有效成分含量在種源間存在著豐富的遺傳變異，因此，開展藥用植物種源選擇能取得很好的遺傳改良效果[25]。本研究結果表明，半夏的總有機酸、生物堿和鳥苷含量在種源間均存在著極顯著差異，與王兵[26]、張君毅[10]、劉冬蘭[17]等的研究結果類似。這些研究結果充分說明半夏的藥用有效成分在種源間存在著豐富的遺傳變異，其遺傳改良和優(yōu)良種源選擇潛力巨大。但相關分析又表明，半夏的總有機酸、生物堿和鳥苷等藥用有效成分含量在種源水平上兩兩之間的相關性均未達顯著水平，說明半夏的總有機酸、生物堿和鳥苷等性狀在種源水平上可能是獨立遺傳的，選育出總有機酸、生物堿和鳥苷含量都高的半夏種源是很有可能的。同時，半夏鳥苷含量的廣義遺傳力達0.6660，受到中等強度以上的遺傳控制。因此，以鳥苷含量為指標來進行半夏優(yōu)良種源的選擇是比較可靠的。

藥用植物的地理變異規(guī)律對于優(yōu)質栽培產(chǎn)區(qū)篩選有重要指導意義[27]。廣布種藥用植物由于其棲息地氣候條件和地勢復雜，往往具備復雜的地理變異特征[19]。相關分析表明，半夏的鳥苷含量表現(xiàn)出比較明顯的緯向變異模式，而總有機酸和生物堿含量則與經(jīng)度、緯度均只呈微弱相關，地理空間變異模式不明顯，與“魚腥草揮發(fā)油類物質總量呈從西到東、從南到北逐漸增加的經(jīng)、緯雙向變異趨勢”[23]相異。聚類分析表明，半夏種源間既存在地理分布相近的種源如溆浦縣和新化縣種源聚為一類的現(xiàn)象，也存在地理分布相隔較遠種源如龍山縣、黎平縣、桃江縣和辰溪縣等種源聚為一類的現(xiàn)象。這說明半夏種源存在隨機變異、區(qū)域板塊變異等地理變異模式，與黃芩化學成分的地理變異趨勢類似[22]。相關分析還表明，環(huán)境氣候因子對半夏的總有機酸、生物堿和鳥苷含量的影響均不顯著。因此，半夏藥材質量的影響因素不能明確劃定為“遺傳型”或“環(huán)境型”，而應是遺傳因子與環(huán)境因素共同作用的結果。因此，優(yōu)質半夏的栽培應優(yōu)先考慮環(huán)境，再選擇種源。對栽培半夏進行品質育種時，可根據(jù)不同環(huán)境和種源分產(chǎn)地選擇，以提高選育效果。

“藥材好，藥才好”。優(yōu)質是藥用植物良種選育的首要目標，主要表現(xiàn)在藥用有效成分含量高低與穩(wěn)定性。按照《中國藥典》2015年版規(guī)定，半夏按干燥品計算，含總有機酸以琥珀酸(C4H6O4)計不得少于0.25%[3]。本研究結果表明，16個種源半夏的總有機酸含量變化范圍為0.310%～0.437%，均遠遠大于《中國藥典》的標準，且?guī)缀跛蟹N源(永定區(qū)除外)的半夏的總有機酸含量均高于目前半夏主產(chǎn)地之一的甘肅西和種源的[28]。這說明湖南產(chǎn)的半夏完全符合半夏藥材生產(chǎn)的要求，在湖南各地發(fā)展半夏生產(chǎn)具有很大的潛力。但是，半夏的藥用成分多而復雜，含有半夏蛋白、生物堿、多糖、亞油酸、琥珀酸類等多種有效成分，僅以總有機酸單個指標遠不能完全代表半夏的整體質量，更不能完全反映其臨床療效。而隸屬函數(shù)分析法能將不同指標放到同一個比較平臺上定量評價，兼顧多個指標對品質的貢獻，并已成功地應用于多種藥用植物品質的綜合評價。比如，張靜等選取產(chǎn)量及可溶性糖、淀粉、纖維素、總黃酮、葛根素含量等為指標，運用隸屬函數(shù)法從10份葛種質資源中篩選出4個適合廣西推廣應用的高產(chǎn)優(yōu)質葛種質資源[29]。羅海玲等以塊莖產(chǎn)量、可溶性蛋白、淀粉、蔗糖和還原糖等為指標，運用隸屬函數(shù)法從31個山藥種質資源中篩選出5個適合作為高產(chǎn)優(yōu)質育種材料或鮮食新品種的優(yōu)異親本等[30]。本研究把總有機酸、生物堿和鳥苷等半夏主要藥用有效成分含量等指標綜合起來衡量半夏品質(質量標準)，針對性更強，更能準確反映半夏種源的藥用品質。根據(jù)隸屬函數(shù)值的排序，新化縣、溆浦縣、吉首市、永順縣等4個種源可作為湖南半夏發(fā)展的優(yōu)良種源。永定區(qū)種源的半夏雖然總有機酸和生物堿含量相對較低，排序靠后，但其鳥苷含量高且穩(wěn)定，可作為鳥苷提取的專用種源，或作為高鳥苷含量品種選育的親本。