王煒清 - 李秀婷 - 周 彬 李述剛 -

(1. 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；2. 北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 102488)

扁桃(AmygdaluscommunisL.)又名巴旦木或巴旦仁，是世界上著名的干果樹(shù)種和木本油料樹(shù)種[1]。扁桃仁營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量脂肪、蛋白質(zhì)、粗纖維、維生素及礦質(zhì)元素等[2-3]，同時(shí)扁桃仁還具有廣泛的保健作用，如可降低糖尿病和冠心病等疾病的發(fā)生[4-5]。但其高脂肪和高蛋白特性使其在加工過(guò)程中易發(fā)生品質(zhì)劣變，如顏色、風(fēng)味等變化，極大地限制了扁桃仁蛋白質(zhì)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。貯藏是產(chǎn)品加工過(guò)程中不可避免的一個(gè)環(huán)節(jié)，不同的貯藏條件將直接影響產(chǎn)品品質(zhì)及貨架期。目前，研究者們[6-8]重點(diǎn)探究堅(jiān)果油在貯藏過(guò)程中的變化，忽略了其蛋白質(zhì)的品質(zhì)變化。

試驗(yàn)擬以扁桃仁分離蛋白(almond protein isolate，API)為研究對(duì)象，以貯藏過(guò)程API結(jié)構(gòu)與功能特性為觀測(cè)指標(biāo)，重點(diǎn)探究不同貯藏條件對(duì)API消化特性的影響，以期為富含脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的堅(jiān)果類產(chǎn)品的貯藏與開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

扁桃仁：購(gòu)自新疆莎車縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；

5,5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽(DTNB)、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)：優(yōu)級(jí)純，美國(guó)Sigma公司；

二硫蘇糖醇(DTT)：分析純，Aladdin阿拉丁試劑公司；

鄰苯二甲醛(OPA)：優(yōu)級(jí)純，美國(guó)Sigma公司；

其他試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：TU-1900型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

圓二色光譜儀：J-1500型，日本JASCO公司；

電泳儀：DYY-8C型，北京六一有限公司；

熒光分光光度計(jì)：F-4600型，日本日立公司；

氨基酸分析儀：L-8900型，日本日立公司；

質(zhì)譜儀：Q Exactive型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 扁桃仁去殼烘干后進(jìn)行真空與非真空包裝，置于不同溫度(4，25，35 ℃)下貯藏，分別于貯藏第0，1，3，6，9個(gè)月取樣進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 基本營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

(1) 水分含量：參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》。

(2) 蛋白質(zhì)含量：參照GB 5009.5—2006《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》的凱氏定氮法。

(3) 脂肪含量：參照GB 5009.6—2016《食品中安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》。

(4) 還原糖含量：參照GB 5009.7—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測(cè)定》。

(5) 灰分含量：參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》。

(6) 氨基酸組成：參照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》。

1.2.3 扁桃仁蛋白的提取 采用堿溶酸沉法制備扁桃仁分離蛋白(almond protein isolate，API)[9]。將扁桃仁脫皮后進(jìn)行磨粉、過(guò)篩，采用石油醚(30～60 ℃)進(jìn)行脫脂得到扁桃仁脫脂粉。將脫脂粉溶于超純水中[1∶30 (g/mL)]并調(diào)節(jié)pH至9.5，35 ℃攪拌3 h后以8 000×g離心20 min。將上清液pH調(diào)至4.5，靜置15 min 后在4 ℃ 下8 000×g離心20 min，水洗沉淀2次。將沉淀物分散于超純水中并調(diào)節(jié)pH至7.0，并在4 ℃ 下透析3 d，冷凍干燥得蛋白粉。

1.2.4 理化特性測(cè)定

(1) 巰基、二硫鍵的測(cè)定：采用Ellman's試劑法[10]。

(2) 羰基價(jià)的測(cè)定：采用DNPH法[11]。

(3) 表面疏水性的測(cè)定：參照Arzeni等[10]的方法，用ANS熒光探針測(cè)定蛋白質(zhì)的表面疏水性(Ho)。

1.2.5 結(jié)構(gòu)特性測(cè)定

(1) 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定：配制0.2 mg/mL的API溶液于0.1 cm的石英比色皿中，掃描波長(zhǎng)為190～250 nm，掃描速率為100 nm/min。

(2) 聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳：參照Moritz等[12]的方法，利用SDS-PAGE對(duì)蛋白質(zhì)分子量變化進(jìn)行分析。濃縮膠與分離膠的濃度分別為4%，12%，電壓分別設(shè)置為70，100 V。

1.2.6 功能特性測(cè)定

(1) 溶解性：根據(jù)Qu等[13]的方法，稍作修改。將API溶液(10 mg/mL)在室溫下攪拌1 h，以8 000 ×g離心20 min，上清液的蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，按式(1)計(jì)算溶解度。

(1)

式中：

S——溶解度，%；

C0——樣品中蛋白質(zhì)含量，mg；

C1——上清液中蛋白質(zhì)含量，mg。

(2) 起泡特性：參照胡靜[14]的方法，利用泡沫分析儀對(duì)扁桃蛋白的起泡性能進(jìn)行測(cè)定。樣品濃度為10 mg/mL。

1.2.7 消化特性的測(cè)定

(1) 消化率：將1 mL胃蛋白酶溶液(40 mg/mL)加入到20 mL樣品溶液(10 mg/mL)中，并將混合物的pH調(diào)節(jié)至2.0。將混合物在37 ℃水浴中于黑暗中振蕩3 h。最后，用0.1 mol/L NaHCO3溶液將樣品溶液的pH值調(diào)節(jié)至7.0，以終止反應(yīng)[15]。采用OPA試劑法[16]測(cè)定API在消化過(guò)程中水解度變化。

(2) 消化產(chǎn)物分析：肽段的分析使用Dionex 3000 RSLC UHPLC系統(tǒng)串聯(lián)Q Exactive質(zhì)譜儀。使用Proteome Discoverer 1.4 (version 1.4, Thermo Fisher Scientific, Palo Alto, CA, USA)匹配肽MS/MS譜；使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(www.uniprot.org, UP000009136)與Sequent搜索算法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；利用Venn圖分析多肽的相似性[17]。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)均平行3次，采用SPSS 23.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，利用Origin 2017軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 扁桃仁的營(yíng)養(yǎng)成分分析

由圖1可知，扁桃仁富含脂質(zhì)(53.53%)與蛋白質(zhì)(21.60%)；扁桃油主要由油酸(C18:1)與亞油酸(C18:2)組成，不飽和脂肪酸含量較高(72.98%)。由表1可知，扁桃仁蛋白質(zhì)含有18種氨基酸，必需氨基酸種類全、含量充足，且相互比例適當(dāng)。由此可知，扁桃仁是一種營(yíng)養(yǎng)組成全面，富含脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的優(yōu)質(zhì)堅(jiān)果資源。

表1 扁桃仁蛋白質(zhì)的氨基酸組成

圖1 扁桃仁的基本成分及其脂肪酸組成

2.2 貯藏條件對(duì)扁桃仁蛋白質(zhì)理化特性影響

蛋白質(zhì)分子中的巰基和二硫鍵對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能特性均有影響，如蛋白質(zhì)的凝膠性、界面行為和消化性能等[18]。如圖2(a)～(d)所示，不同貯藏條件下API游離巰基和二硫鍵的含量不同。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，所有樣品的巰基含量均顯著降低，對(duì)照組(儲(chǔ)存0 d)的巰基含量為20.64 μmol/g，而非真空包裝于35 ℃貯藏9個(gè)月后其巰基含量降低了60.7%。結(jié)果表明較高的貯藏溫度可導(dǎo)致API的巰基含量顯著降低。而貯藏期間，API的二硫鍵含量變化趨勢(shì)與巰基相反。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，二硫鍵含量從11.32 μmol/g增加到30.21 μmol/g。這可能是貯藏過(guò)程中的氧氣、光以及脂質(zhì)氧化會(huì)誘導(dǎo)扁桃仁中蛋白質(zhì)的氧化變性，而蛋白質(zhì)變性和二硫鍵的形成都可能導(dǎo)致巰基含量的減少。

蛋白質(zhì)氧化的另一個(gè)重要變化是羰基(包括醛基和酮基)的形成。氨基酸側(cè)鏈的直接氧化、肽鏈的裂解、糖的還原或與非蛋白質(zhì)羰基化合物的結(jié)合均可產(chǎn)生羰基[18]。如圖2(e)和(f)所示，對(duì)照樣品的羰基含量為0.11 μmol/g，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，所有樣品的羰基值急劇增加(P<0.05)。另外，相同的貯藏時(shí)間下，不同的貯藏溫度也會(huì)引起羰基值的顯著差異，且羰基值與貯藏溫度呈正相關(guān)。劉寶華等[19]研究大豆分離蛋白質(zhì)在貯藏期的變化，結(jié)果表明隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)羰基值逐漸增加，與試驗(yàn)的變化趨勢(shì)相同。

蛋白質(zhì)分子的表面疏水性可以反映其表面疏水基團(tuán)的相對(duì)含量，是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要特性[18]。如圖2(g)和(h)所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，表面疏水性呈明顯的上升趨勢(shì)。真空包裝處理的扁桃仁在35 ℃貯藏9個(gè)月后，API表面疏水性變化最為顯著，從3 050增加到8 142。這可能是由于：扁桃仁貯藏期間，外部因素會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化，導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生變化。隨著氧化程度的增加，API分子逐漸展開(kāi)，其內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致表面疏水性增加。

*表示在0.1水平上顯著

2.3 貯藏條件對(duì)扁桃仁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性的影響

2.3.1 二級(jí)結(jié)構(gòu) 試驗(yàn)通過(guò)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化考察不同貯藏條件下API的氧化程度。由表2可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的含量逐漸增加，而α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量降低。非真空條件下(35 ℃)貯藏9個(gè)月后，API的α-螺旋含量從31.4%降低到19.1%，β-折疊含量從30.1%增加到43.5%，β-轉(zhuǎn)角含量從12.1%降低到2.5%，無(wú)規(guī)則卷曲從26.5%增加到34.9%。比較兩種包裝條件下的貯藏樣品，發(fā)現(xiàn)在真空包裝條件下，API二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化略低于非真空包裝組。吳偉等[20]研究發(fā)現(xiàn)貯藏過(guò)程中大米蛋白質(zhì)的無(wú)序結(jié)構(gòu)逐漸增加，二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性逐漸降低。

表2 貯藏期間API二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

2.3.2 SDS-PAGE 圖3顯示了API在不同貯藏條件下的電泳圖譜，初始API的分子量主要集中分布在35～40 kDa 和10～15 kDa，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，在15 kDa和35～40 kDa左右的主要蛋白帶逐漸消失或消失，而在50～70 kDa的蛋白帶則明顯增厚；尤其是貯藏超過(guò)6個(gè)月后，在泳道的頂部出現(xiàn)條帶。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的遷移率逐漸降低，可能是由于過(guò)氧自由基蛋白的氧化導(dǎo)致了API分子中的共價(jià)交聯(lián)，形成高分子量聚集體。同時(shí)，蛋白質(zhì)氧化的加深也將導(dǎo)致某些蛋白質(zhì)分子的降解，從而在低分子量區(qū)域產(chǎn)生離散的條帶。

1～3. 分別于4，25，35 ℃貯藏的真空包裝樣品 4～6. 分別于4，25，35 ℃貯藏的非真空包裝樣品 Mark. 蛋白質(zhì)標(biāo)品

2.4 貯藏條件對(duì)扁桃仁蛋白質(zhì)功能特性的影響

如圖4(a)和(b)所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，API的溶解度明顯降低。非真空包裝、35 ℃貯藏9個(gè)月后，其溶解度降低了85.3%。貯藏期間API溶解度降低的主要原因有兩個(gè)：① 貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)，形成較大分子量的聚集體，最終導(dǎo)致API溶解度降低；② API的表面疏水性在貯藏過(guò)程中增強(qiáng)，并且暴露的疏水基團(tuán)可能通過(guò)疏水性相互作用聚集，導(dǎo)致溶解度降低。何鐘瑜等[21]研究發(fā)現(xiàn)蛋黃在不同溫度下貯藏后，溶解度均發(fā)生下降，并認(rèn)為這可能是蛋白質(zhì)氧化所致。

如圖4(c)～(f)所示，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，API的起泡能力與泡沫半衰期逐漸降低。API起泡特性在貯藏期間發(fā)生變化可能是由于隨著API氧化程度的加深，不斷暴露的疏水基團(tuán)形成不可溶的聚集體，改變了蛋白質(zhì)分子的表面張力和氣—液界面的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致其起泡能力與泡沫穩(wěn)定性顯著下降[22]。另外，有研究[23]表明蛋白質(zhì)氧化會(huì)導(dǎo)致其溶解性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的起泡特性，該結(jié)果與API分子量、溶解性等變化趨勢(shì)相符。

*表示在0.1水平上顯著

2.5 貯藏條件對(duì)扁桃蛋白消化特性的影響

2.5.1 消化率 貯藏引起的蛋白質(zhì)氧化可能導(dǎo)致一系列氨基酸的丟失和變性，可能導(dǎo)致API及相關(guān)產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值顯著下降。因此，通過(guò)體外模擬胃消化試驗(yàn)研究了不同貯藏條件處理的API消化特性(圖5)，研究發(fā)現(xiàn)，不同貯藏條件處理API經(jīng)胃蛋白酶酶解后，體外消化率表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)。3個(gè)溫度下貯藏9個(gè)月后，API的水解度顯著降低，而較高的溫度導(dǎo)致水解度的降低更為顯著。這可能是較高的溫度和較長(zhǎng)的貯藏時(shí)間導(dǎo)致API氧化，形成共價(jià)交聯(lián)的氧化聚集體，掩蓋了API胃蛋白酶的作用部位，從而減慢了胃蛋白酶的消化過(guò)程并抑制了API的消化。同時(shí)，這與蛋白質(zhì)氧化晚期階段聚集體的形成有關(guān)，一方面抵消了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)的作用，另一方面，氨基酸的損失也影響了酶促水解的速率。此外，已有研究[24]表明二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量會(huì)影響蛋白質(zhì)的體外消化率，α-螺旋的含量越高，蛋白質(zhì)的消化越容易，而β-折疊的含量越高，則抑制蛋白質(zhì)消化。何莉媛等[25]研究也發(fā)現(xiàn)貯藏期間米糠蛋白的消化率隨貯藏時(shí)間逐漸降低。

圖5 貯藏條件對(duì)API消化率的影響

2.5.2 消化產(chǎn)物分析 基于MS對(duì)API消化產(chǎn)物分子量分析，以進(jìn)一步評(píng)估在不同貯藏條件長(zhǎng)期貯藏后扁桃仁的蛋白質(zhì)消化率的差異。如圖6所示，API消化產(chǎn)物的分子量主要集中在3 000 Da以下，貯藏9個(gè)月后，API消化產(chǎn)物分子量增大。這也證實(shí)了水解度的結(jié)果，該水解會(huì)抑制API的消化。圖7顯示了初始樣品及分別在4，25，35 ℃真空包裝的樣品貯藏9個(gè)月后經(jīng)胃蛋白酶處理得到的獨(dú)有肽段數(shù)，分別為9 618，8 851，8 354，8 554，其中有2 147個(gè)共有肽段。初始樣品與非真空包裝在4，25，35 ℃貯藏9個(gè)月后的樣品，分別具有9 663，9 037，8 888，6 728個(gè)獨(dú)有肽段。此外，非真空包裝的扁桃仁于35 ℃貯藏9個(gè)月后，API消化產(chǎn)物的肽段數(shù)量從13 096急劇減少至8 662，這是由于蛋白質(zhì)的消化率越高，獨(dú)有肽段的數(shù)量越多，該結(jié)果與水解度的結(jié)果一致。

圖6 不同貯藏條件下的API消化產(chǎn)物的肽指紋圖譜

圖7 不同貯藏條件下API肽段韋恩圖

3 結(jié)論

通過(guò)探討扁桃仁分離蛋白在不同貯藏溫度、包裝方式以及貯藏時(shí)間下的理化指標(biāo)、結(jié)構(gòu)與功能特性、消化特性變化來(lái)探究其貯藏特性，結(jié)果表明扁桃仁分離蛋白在貯藏期間結(jié)構(gòu)特性發(fā)生改變，進(jìn)而影響其功能特性與消化特性。因此，在扁桃的加工、貯運(yùn)過(guò)程中，應(yīng)盡量避免扁桃仁蛋白質(zhì)暴露在劇烈的環(huán)境條件中，防止蛋白質(zhì)品質(zhì)下降造成資源流失。后續(xù)將進(jìn)一步探究扁桃仁蛋白質(zhì)在貯藏期間的品質(zhì)變化規(guī)律與機(jī)制。