楊雪梅 ，徐新明，付雪峰，杜建文，王 丹，田月珍，田可川*，黃錫霞*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所新疆絨毛用羊遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830011）

毛發(fā)是毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的產(chǎn)物，是重要的動(dòng)物產(chǎn)品和紡織原材料。毛囊是皮膚的衍生物，其結(jié)構(gòu)和特性決定了毛發(fā)的品質(zhì)及產(chǎn)量[1]。毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜且長(zhǎng)期的生理過程，受多種物理因素[2]、多種分子及信號(hào)通路[3]調(diào)控，而基因表達(dá)是影響動(dòng)物毛發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育的決定性因素之一[4]。因此，了解毛囊發(fā)育相關(guān)基因的功能有助于深入了解毛囊發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制。有研究表明，WNT 信號(hào)通路參與了毛囊生長(zhǎng)發(fā)育過程中的多個(gè)重要環(huán)節(jié)，且對(duì)毛囊干細(xì)胞的調(diào)控至關(guān)重要[5]。WNT2基因是目前研究最廣泛且能激活經(jīng)典通路的WNT 信號(hào)之一[6]，并參與了細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)節(jié)，與癌癥有密切關(guān)系[7]。WNT 信號(hào)通路中的WNT2在毛囊形態(tài)發(fā)生中起到重要作用[8]。因此，推測(cè)WNT2基因可能是綿羊羊毛性狀的潛在候選基因。

表觀遺傳學(xué)修飾是指在基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，通過某些機(jī)制決定基因表達(dá)，并引起細(xì)胞表型的變化，從而影響到生命活動(dòng)。影響基因轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳學(xué)調(diào)控包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)等[9]。DNA 甲基化是基因表達(dá)調(diào)控中的重要問題，也是遺傳學(xué)和繁殖領(lǐng)域的重要問題。DNA 甲基化是最早被發(fā)現(xiàn)也是目前研究最深入的表觀遺傳修飾之一。有研究表明，在家畜生長(zhǎng)發(fā)育過程中，DNA 甲基化參與許多代謝過程[10]，并且DNA 甲基化在家畜中已被廣泛研究。

本研究以蘇博美利奴羊?yàn)檠芯繉?duì)象，分別從表觀遺傳和分子遺傳2 個(gè)方面來分析皮膚組織中WNT2基因的DNA 甲基化程度與表達(dá)量之間的關(guān)系，旨在探討DNA 甲基化對(duì)羊毛性狀發(fā)育調(diào)控的影響，以期填補(bǔ)細(xì)毛羊DNA 甲基化研究領(lǐng)域的空白，為細(xì)毛羊重要經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)標(biāo)記輔助選擇工作提供有效的表觀遺傳標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為新疆鞏乃斯種羊場(chǎng)所提供的健康無病、體況均勻的周歲蘇博美利奴母羊，分別選取5 只平均纖維直徑為16.90 μm（極細(xì)組）和5 只平均纖維直徑為19.53 μm（極粗組）的周歲蘇博美利奴母羊，采集其左側(cè)肩胛部皮膚2 cm×2 cm 組織樣品并用液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器 TIANamp Genomic DNA Kit（DP304）、TIANquick Midi Purification Kit（DP204-02）購(gòu)自天根生化科技有限公司（北京）；EZ DNA Methylation-GOLD Kit（D5005）、ZymoTaqTMPreMix（E2003）購(gòu)自ZYMO Research 公司；EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Low Rox、5X All-In-One MasterMix （with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）購(gòu)自ABM（加拿大）；pMD19-T Vector Cloning Kit（6013）、E.coli JM109 Competent Cells（9052）購(gòu)自TaKaRa 公司（大連）；TRIzol RNA分離試劑、Amp、胰蛋白胨、酵母提取物、DL 2000 DNA Marker、瓊脂糖、6×Loading Buffer 等。

主要使用儀器有ZHJH C1112B 型超凈工作臺(tái)、Light Cycler2.0 熒光定量PCR 儀、NANODROP 2000型分光光度計(jì)、BIOFUGE PRIMOR 型低溫離心機(jī)、DNP-9082A 型電熱恒溫培養(yǎng)箱、ZHWY-2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器、凝膠成像儀等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA 提取及亞硫酸氫鹽修飾 根據(jù)TIA Namp Genomic DNA Kit（DP304）說明書對(duì)10 只蘇博美利奴羊個(gè)體的皮膚組織進(jìn)行基因組DNA 提取，并使用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將檢測(cè)合格的基因組DNA 按EZ DNA Methylation-GOLD Kit（D5005） 說明書進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。

1.3.2 CpG 島預(yù)測(cè)及引物設(shè)計(jì) 利用在線軟件MethPrimer預(yù)測(cè)從NCBI 獲得的綿羊WNT2基因第5 外顯子及前后100 bp 序列的CpG 島并設(shè)計(jì)BSP 引物（WNT2-bsp），并根據(jù)NCBI 上公布的綿羊WNT2基因（登錄號(hào)：NM_001195319.1）與基因（登錄號(hào)：NM_001190390.1）的序列，利用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行定量引物設(shè)計(jì)，最后由上海生工生物工程有限公司合成，引物信息見表1。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物純化 對(duì)目的基因WNT2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體系25 μL：ZymoTaqTMPreMix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板 2 μL，用RNase-free ddH2O 補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性10 min，變性94℃ 30 s，退火53.8℃ 30 s，延伸72℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min，4℃ 5 min。隨機(jī)選擇PCR 產(chǎn)物取2 μL 與3 μL 的6×Loading Buffer 混勻，經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠180 V 電泳25 min，以DL2000 為Marker 來標(biāo)記產(chǎn)物片段的大??；之后使用凝膠成像儀進(jìn)行照膠，若獲得的產(chǎn)物片段與預(yù)期片段大小一致，根據(jù)TIANquick Midi Purification Kit（DP204-02）說明書對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化。

表1 引物序列信息

1.3.4 克隆及DNA 甲基化序列分析 根據(jù)pMD19-T Vector Cloning Kit（6013）說明書，取3.5 μL 純化產(chǎn)物與pMD19-T 載體連接，并轉(zhuǎn)化至JM109 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LA 固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。每個(gè)樣本挑取3 個(gè)陽(yáng)性單克隆接種至LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR 鑒定后送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.3.5 總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄成cDNA 取50～100 mg 樣品于液氮中研磨成粉末狀，使用TRIzol 法進(jìn)行總RNA的提取。使用核酸檢測(cè)儀對(duì)其濃度與純度進(jìn)行檢測(cè)，使用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，根據(jù)5X All-In-One MasterMix 說明書對(duì)合格的RNA 樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.6WNT2基因的表達(dá)量研究 以GAPDH為內(nèi)參基因，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，根據(jù)EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Low Rox 說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，總反應(yīng)體系20 μL：EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，95℃ 5 s，共40 個(gè)循環(huán)，65℃ 5 s，95℃ 5 s。每個(gè)樣品均為3 個(gè)生物信息學(xué)重復(fù)。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS19.0 軟件獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)對(duì)表達(dá)量結(jié)果進(jìn)行差異比較，P<0.05 被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 CpG 島預(yù)測(cè) 通過在線軟件MethPrimer 預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)蘇博美利奴羊WNT2基因第5 外顯子及前后100 bp的DNA 序列有1 個(gè)CpG 島，其具體位置是220～354 bp，長(zhǎng)度為135 bp，CpG 島具體位置見圖1。

圖1 WNT2 基因的CpG 島預(yù)測(cè)圖

通過在線軟件MethPrimer 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)WNT2基因的CpG 島，并針對(duì)該區(qū)域設(shè)計(jì)了甲基化引物，發(fā)現(xiàn)目的片段在160～389 bp，產(chǎn)物大小在230 bp，如圖2 所示，該片段共包含13 個(gè)潛在的DNA 甲基化位點(diǎn)，GC 含量為53.85%。

圖2 WNT2 基因甲基化區(qū)域預(yù)測(cè)序列

2.2 不同細(xì)度蘇博美利奴羊WNT2基因的DNA 甲基化模式分析和序列比對(duì)

2.2.1 蘇博美利奴羊WNT2基因經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后的擴(kuò)增結(jié)果 使用引物WNT2-bsp進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖3 所示，在230 bp處獲得單一的目的條帶，且沒有引物二聚體，符合預(yù)期片段大小，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 亞硫酸氫鹽修飾后WNT2 基因擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

2.2.2 蘇博美利奴羊WNT2基因的序列比對(duì) 對(duì)蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2基因第5 外顯子及前后100 bp 序列進(jìn)行DNA 甲基化分析，根據(jù)未甲基化的胞嘧啶經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后被轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后不被轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶的原理，分析不同細(xì)度蘇博美利奴羊WNT2基因的甲基化模式，見圖4，經(jīng)序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有13 個(gè)CpG 位點(diǎn)，與Meth Primer 軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

2.2.3 不同細(xì)度蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2基因的DNA 甲基化水平 分別對(duì)極細(xì)組和極粗組的蘇博美利奴羊WNT2基因挑取3 個(gè)陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)，結(jié)果如圖5 所示。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)極細(xì)組和極粗組的CpG 位點(diǎn)的DNA 甲基化水平均較高且差異不顯著，分別為92.31%、88.21%。

以極細(xì)組的甲基化水平為對(duì)照，對(duì)每個(gè)CpG 位點(diǎn)的DNA 甲基化水平計(jì)算，結(jié)果如表2 所示，CpG4、CpG9 以及CpG10 在2 組中的甲基化水平一致，均為93%，而極粗組的CpG2、CpG3 的甲基化水平高于極細(xì)組，其余位點(diǎn)的甲基化水平均低于極細(xì)組。

2.3 不同細(xì)度蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2基因的表達(dá)量研究 由圖6 可知，極細(xì)組的表達(dá)量較極粗組高出1.88 倍（P<0.05），并且WNT2基因在2 組中的mRNA 表達(dá)量與甲基化水平的變化趨勢(shì)一致。

WNT2基因的每個(gè)CpG 位點(diǎn)在不同細(xì)度蘇博美利奴羊皮膚組織中的甲基化水平各不相同，其中，CpG11位點(diǎn)在2 組中的甲基化水平差異最大。對(duì)極細(xì)組與極粗組的10 個(gè)蘇博美利奴羊個(gè)體的每一個(gè)CpG 位點(diǎn)與表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，通過表3 發(fā)現(xiàn)，CpG11 位點(diǎn)的甲基化水平與表達(dá)量之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P<0.05，r=0.693）。

3 討 論

圖4 WNT2 基因甲基化區(qū)域測(cè)序峰圖

圖5 不同細(xì)度蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2 基因的甲基化模式圖

圖6 不同細(xì)度蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2 基因的表達(dá)量及甲基化程度

毛囊的發(fā)生發(fā)育對(duì)羊毛的產(chǎn)量與質(zhì)量有重要影響，毛囊的發(fā)育過程非常復(fù)雜。WNT 家族編碼大量分泌蛋白，作為信號(hào)蛋白在細(xì)胞間傳遞，影響細(xì)胞的分化、增殖、遷移，參與多種組織器官的發(fā)育[11]。譚強(qiáng)等[12]研究表明，WNT2基因的表達(dá)量隨著胎兒發(fā)育逐漸增高，說明WNT2基因是調(diào)控山羊胎兒早期發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵因子。趙博昊[13]利用高通量測(cè)序技術(shù)篩選出與獺兔毛色相關(guān)的基因及信號(hào)通路，通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)WNT2基因與毛色形成相關(guān)。FGF5對(duì)毛囊的發(fā)育有抑制作用，而馮新宇等[14]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除綿羊皮膚成纖維細(xì)胞WNT2基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WNT2基因表達(dá)量極顯著下調(diào)，F(xiàn)GF5基因表達(dá)量顯著上調(diào)，說明WNT2對(duì)FGF5有抑制作用，從而導(dǎo)致WNT2基因敲除后抑制了毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育，表明WNT2基因?qū)γ业纳L(zhǎng)發(fā)育具有促進(jìn)作用。本研究發(fā)現(xiàn)WNT2基因在極細(xì)組的表達(dá)量顯著高于極粗組，表明WNT2基因可能參與羊毛纖維直徑的形成，對(duì)羊毛纖維直徑的大小有影響。

基于對(duì)DNA 甲基化與基因表達(dá)的深入研究發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基化在人類的生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)展過程中的作用機(jī)制逐漸被揭示，同時(shí)對(duì)動(dòng)植物DNA 甲基化功能的研究，可為后續(xù)動(dòng)植物的繁育工作提供改良依據(jù)。Li 等[15]展示了鳥類的全基因組DNA 甲基化圖譜，并揭示了雞的甲基化模式，發(fā)現(xiàn)雞基因組中的大多數(shù)CpG 島保持未甲基化狀態(tài)。Lan 等[16]在成年山羊中發(fā)現(xiàn)Dnmt3b基因5'區(qū)域的第11 個(gè)CpG-二核苷酸基因座的DNA 甲基化與體重之間存在顯著關(guān)聯(lián)。姚力丹等[17]分析了肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）基因在肌肉和脂肪中的DNA 甲基化模式及mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果表明巴什拜羊肌肉和脂肪MSTN基因DNA 甲基化水平與MSTN基因表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)。Bai 等[18]研究表明遼寧絨山羊毛發(fā)生長(zhǎng)初期毛囊中HOXC8外顯子1 的甲基化程度可能參與調(diào)控遼寧絨山羊羊絨纖維的生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)WNT2基因在極細(xì)組和極粗組中的甲基化程度均較高，為進(jìn)一步研究WNT2基因與羊毛纖維直徑的關(guān)系提供了基礎(chǔ)資料。

表2 不同細(xì)度蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2 基因的CpG 位點(diǎn)的DNA 甲基化水平 %

表3 WNT2 基因mRNA 表達(dá)量與CpG 位點(diǎn)的相關(guān)性

通常情況下，啟動(dòng)子區(qū)域高度甲基化的基因表現(xiàn)出低的表達(dá)水平，而低度甲基化的基因表現(xiàn)出高的表達(dá)水平，說明DNA 甲基化會(huì)抑制基因的轉(zhuǎn)錄過程[19-21]。然而，外顯子區(qū)域甲基化水平的作用機(jī)制與啟動(dòng)子區(qū)域有所不同。有研究表明，基因最后一個(gè)外顯子的甲基化強(qiáng)度，以及基因的上游和下游區(qū)域的甲基化水平對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的影響大于啟動(dòng)子的甲基化水平對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響[22]。阮亦麒等[23]研究發(fā)現(xiàn)RARRES1基因第1 外顯子的CpG9 與CpG16 的甲基化水平與RARRES1基因在香豬高產(chǎn)仔組的較高表達(dá)水平有關(guān)。何小龍等[24]研究發(fā)現(xiàn)烏珠穆沁羊GDF11基因外顯子1 甲基化水平對(duì)其表達(dá)有促進(jìn)作用。本研究發(fā)現(xiàn)WNT2基因在極粗和極細(xì)組中的表達(dá)量與甲基化水平的變化趨勢(shì)一致，與前人研究[23-24]結(jié)果一致。可能是由于本研究設(shè)計(jì)引物選擇了WNT2基因的第5 外顯子區(qū)域，WNT2基因的第5 外顯子區(qū)域是最后一個(gè)外顯子，該區(qū)域的DNA 甲基化水平對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的影響大于啟動(dòng)子區(qū)域。本研究表明，WNT2基因在2 組中的DNA 甲基化水平均較高。同時(shí)，WNT2基因在蘇博美利奴羊極細(xì)組的表達(dá)量顯著高于極粗組，且CpG11 的甲基化水平與mRNA 表達(dá)量之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，表明WNT2基因的DNA 甲基化水平促進(jìn)WNT2基因在蘇博美利奴羊皮膚組織中的表達(dá)，并且DNA 甲基化水平對(duì)WNT2基因的表達(dá)有一定影響，推測(cè)蘇博美利奴羊皮膚組織中WNT2基因通過DNA 甲基化修飾從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，并調(diào)控了蘇博美利奴羊的羊毛纖維直徑，可作為一個(gè)候選的表觀遺傳標(biāo)記。然而，闡明WNT2基因第5 外顯子的DNA 甲基化水平調(diào)控蘇博美利奴羊羊毛生長(zhǎng)的分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)WNT2基因在極細(xì)組和極粗組中的甲基化程度均較高，且2 組DNA 甲基化程度與表達(dá)量水平的變化趨勢(shì)一致，同時(shí)，CpG11 位點(diǎn)的甲基化水平與mRNA 表達(dá)量之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，該位點(diǎn)與羊毛纖維直徑有關(guān)，表明WNT2基因的DNA 甲基化水平對(duì)羊毛纖維直徑有一定作用，可作為一個(gè)候選的表觀遺傳標(biāo)記。