王 沖，徐 琳，華曉東

（天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070）

細(xì)胞治療產(chǎn)品主要分為干細(xì)胞及免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品兩大類，作為近年來國(guó)際醫(yī)學(xué)的前沿發(fā)展領(lǐng)域，在治療和緩解惡性腫瘤、嚴(yán)重創(chuàng)傷等疑難雜癥方面，表現(xiàn)出了其他方法無法企及的療效，具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的商業(yè)價(jià)值［1］。熱原系指能引起恒溫動(dòng)物體溫異常升高的致熱物質(zhì)，主要包括細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。作為非腸道類給予的藥物，熱原為《中國(guó)藥典》規(guī)定必須的檢測(cè)項(xiàng)目［2］。細(xì)胞治療產(chǎn)品在回輸患者時(shí)，發(fā)熱反應(yīng)為最常見的不良反應(yīng)之一，此現(xiàn)象為肌體免疫機(jī)制所致，臨床醫(yī)生也可以根據(jù)患者發(fā)熱情況預(yù)估對(duì)治療產(chǎn)品的療效［3］。因此，此類產(chǎn)品對(duì)于控制熱原物質(zhì)的要求尤為突出，否則不但會(huì)引起發(fā)熱效應(yīng)的疊加，造成嚴(yán)重臨床反應(yīng)，還會(huì)干擾臨床醫(yī)生的判斷。

家兔法為熱原檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但對(duì)于本類產(chǎn)品，卻存在種屬差異及檢品用量大等明顯的不適用性?，F(xiàn)行版《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》中推薦使用的細(xì)菌內(nèi)毒素法也面臨僅對(duì)革蘭陰性菌敏感、鱟試劑資源緊缺等問題。近年來，各國(guó)相繼開展新的熱原檢測(cè)方法的研究，單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定法（monocyte activation test，MAT）已被《英國(guó)藥典》和《歐洲藥典》收載，但該方法中所載人全血和人外周血法對(duì)人血的要求較高，且來源困難；而細(xì)胞系法中推薦的MM6和THP-1細(xì)胞株在國(guó)內(nèi)又無法獲得，限制了MAT法在國(guó)內(nèi)的推廣和使用［4］。本文報(bào)道人早幼粒白血病細(xì)胞株（HL-60）體外熱原檢測(cè)方法，并對(duì)相關(guān)影響因素進(jìn)行考查，選取部分細(xì)胞治療產(chǎn)品進(jìn)行適用性研究，以期為細(xì)胞治療產(chǎn)品建立一種新的熱原檢測(cè)途徑。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 酶標(biāo)儀，型號(hào)SpectiaMax M2，Molecular Devices公司生產(chǎn)；離心機(jī)，型號(hào)VELOCITY 18R，Dynamica公司生產(chǎn)；Attune NxT流式細(xì)胞儀，life technologies公司生產(chǎn)。

1.2 試藥 人間充質(zhì)干細(xì)胞（骨髓及脂肪來源MSC）、人樹突細(xì)胞（DC）、T細(xì)胞和嵌合CD19抗原的T細(xì)胞（CAR-T）均由天津現(xiàn)代醫(yī)藥開發(fā)研究所提供；熱原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)150800-201601，規(guī)格：9 000 EU/支，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號(hào)1708090，規(guī)格：50 ml/瓶，湛江安度斯生物有限公司）；胎牛血清（FBS，批號(hào) 20170420，規(guī)格：100 ml/瓶，杭州天杭生物科技股份有限公司）；IMDM 培養(yǎng)基（批號(hào) 2003791，規(guī)格：500 ml/瓶，Biological Industries公司）；人IL-6 ELISA試劑盒（批號(hào)1807-4，規(guī)格：96 T，達(dá)科為公司）；CD3-APC抗體（批號(hào)201808004，規(guī)格：2.0 ml/100 T，天津曠博協(xié)和生物技術(shù)有限公司）；CD3-IgG抗體（批號(hào)201801052，規(guī)格：2.0 ml/100 T，天津曠博協(xié)和生物技術(shù)有限公司）；FITC AnnexinV/Dead Cell凋亡試劑盒（批號(hào)1809491，規(guī)格：100 T，invitrogen公司）。

1.3 細(xì)胞株 人早幼粒白血病細(xì)胞株（HL-60）購自中科院上海細(xì)胞庫，以含20%FBS的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)，定期傳代。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的初步建立參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法［5，6］，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，以維持培養(yǎng)基（含2%FBS的IMDM培養(yǎng)基）洗滌1次，重懸后調(diào)整至濃度為5×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μl。細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品作為熱原標(biāo)準(zhǔn)品，取1支用1 ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用水復(fù)溶，渦旋混合器混合30 min。用維持培養(yǎng)基依次稀釋為 0、0.06、0.125、0.25、0.5、1、2及4 EU/ml，每稀釋一步需在渦旋混合器上混勻30 s，取100 μl加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)與細(xì)胞混合均勻，至終濃度分別為 0、0.03、0.06、0.125、0.25、0.5、1 及 2 EU/ml的熱原標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度平行4孔。于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24 h，1 200 r/min離心5 min，取上清液按照ELISA試劑盒中方法測(cè)定IL-6含量。以熱原標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以IL-6吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)影響因素考查

2.2.1 不同細(xì)胞代次的影響 分別取第5、10、15、20和25代HL-60細(xì)胞，按照“2.1”項(xiàng)下方法接種，每孔加入熱原標(biāo)準(zhǔn)品溶液至終濃度為0.125 EU/ml，平行4孔。于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24 h后測(cè)定IL-6含量。

2.2.2 不同孵育時(shí)間的影響 按照“2.1”項(xiàng)下方法接種細(xì)胞，每孔加入熱原標(biāo)準(zhǔn)品溶液至終濃度為0.125 EU/ml，混勻。于37℃、5%二氧化碳條件下分別培養(yǎng)24、48和72 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行4孔，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定IL-6含量。

2.2.3 不同細(xì)胞密度的影響 取HL-60細(xì)胞，分別調(diào)整為 2×106、4×106、6×106、8×106及 10×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，按“2.1”項(xiàng)下方法接種，每孔 100 μl，平行 4孔。每孔加入熱原標(biāo)準(zhǔn)品溶液至終濃度為0.125 EU/ml。于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24 h后測(cè)定IL-6含量。

2.2.4 不同顯色時(shí)間的影響 取HL-60細(xì)胞調(diào)整為2×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，按“2.1”項(xiàng)下方法接種，每孔加入熱原標(biāo)準(zhǔn)品溶液至終濃度為0.125 EU/ml，混勻。于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24 h后，按照說明書中方法分別顯色 5、10、15、20和 25 min，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行4孔，加入反應(yīng)終止液，測(cè)定IL-6含量。

2.2.5 不同胎牛血清含量的影響 取HL-60細(xì)胞，以無血清的IMDM培養(yǎng)基洗滌1次，分別以含0%、2%、4%、6%、8%及10%FBS的IMDM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整為2×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，按“2.1”項(xiàng)下方法接種，每個(gè)血清濃度平行4孔。每孔加入熱原標(biāo)準(zhǔn)品溶液至終濃度為0.125 EU/ml，混勻。于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24 h后測(cè)定IL-6含量。

2.3 干擾試驗(yàn) 干擾試驗(yàn)以供試品溶液對(duì)熱原物質(zhì)回收率的影響程度表示。選取濃度為0.125 EU/ml的熱原標(biāo)準(zhǔn)品作為干擾試驗(yàn)中添加的熱原濃度。將供試品溶液、添加干擾熱原的供試品溶液和熱原標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得的熱原含量分別記為a、b和c。按下式計(jì)算熱原的回收率（R）：R=（b-a）/c×100%。當(dāng)R在 50%～200%之間，則認(rèn)為此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。

2.4 供試品最大有效稀釋倍數(shù)計(jì)算 按照《中國(guó)藥典》中公式L=K/M確定供試品熱原物質(zhì)限值（L）（計(jì)算值），然后按照公式MVD=C·L/λ確定供試品最大有效稀釋倍數(shù)（maximum valid dilution，MVD）（C為供試品溶液濃度；λ為本方法本次試驗(yàn)的最低檢測(cè)限）［7］。在實(shí)際操作中，對(duì)于化學(xué)藥物的大輸液治療產(chǎn)品，熱原限值一般采用比較嚴(yán)格的規(guī)定，定為0.50 EU/ml。λ采用0.06，則MVD為8。供試品臨用前均使用維持培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。供試品同時(shí)按照《中國(guó)藥典》動(dòng)態(tài)顯色法進(jìn)行檢測(cè)，與新方法結(jié)果進(jìn)行平行比較。

2.5 供試品的判定標(biāo)準(zhǔn) 供試品稀釋液不存在干擾作用下，若供試品稀釋液測(cè)得的吸光度（A）值小于該方法的檢測(cè)閾值（0 EU/ml的平均值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差），則規(guī)定為未檢出；將供試品稀釋液測(cè)得的A值帶入?yún)?shù)方程，求得供試品稀釋液的熱原含量，乘以其稀釋倍數(shù)后，得到供試品熱原物質(zhì)含量，如小于限值，判定供試品符合規(guī)定，反之，則判定供試品不符合規(guī)定。

2.6 對(duì)干擾試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，以維持培養(yǎng)基洗滌1次，重懸后調(diào)整為2×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μl。將T細(xì)胞及CART細(xì)胞4倍稀釋液，每孔100 μl加入培養(yǎng)板中，與HL-60細(xì)胞混勻，于37℃、5%二氧化碳條件下共同孵育24 h，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。將孔內(nèi)細(xì)胞懸液移至EP管中，加入 CD3 抗體 10 μl，避光孵育 15 min，1 200 r/min離心5 min，PBS洗滌1次，binding buffer重懸后，依次加入Annexin V-FITC及PI抗體避光染色15 min后，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式圖中CD3陰性群即為HL-60細(xì)胞群，分析T及CAR-T細(xì)胞對(duì)HL-60細(xì)胞的影響［8］。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的初步建立 HL-60細(xì)胞受0.06～2 EU/ml的熱原物質(zhì)刺激后分泌IL-6的量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.994 0），見圖 1。

圖1 HL－60/IL－6法標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)影響因素考查 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)影響因素見圖2。其中A圖結(jié)果顯示，除第5代細(xì)胞外，其他代次的HL-60細(xì)胞對(duì)熱原物質(zhì)反應(yīng)敏感性未見明顯差異，最佳細(xì)胞代次為10～25代細(xì)胞；B圖表明，孵育24 h，IL-6釋放量最大，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-6釋放量降低，故最佳孵育時(shí)間為24 h；C圖表明，孔內(nèi)接種細(xì)胞數(shù)量在20×104～100×104范圍內(nèi)，分泌IL-6量與細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.946 8），故每孔接種20×104個(gè)細(xì)胞最為經(jīng)濟(jì)；D圖表明，伴隨顯色時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-6吸光度值增加，每5 min約增加0.1，為盡可能降低背景值，節(jié)省操作時(shí)間，顯色時(shí)間選用5～10 min；E圖表明，IL-6吸光度值隨著血清濃度增加而逐漸降低，說明FBS對(duì)IL-6釋放存在一定的干擾作用，其中0%血清時(shí)，IL-6分泌量最大，與2%血清時(shí)比較，有顯著性差異（P＜0.05），考慮為細(xì)胞饑餓導(dǎo)致自發(fā)釋放率增多現(xiàn)象，故最佳血清濃度選擇2%。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線影響因素考查

3.3 細(xì)胞治療產(chǎn)品的熱原檢測(cè) 細(xì)胞治療產(chǎn)品干擾試驗(yàn)的回收率均在50%～200%之間，熱原物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果均為未檢出或陰性，與動(dòng)態(tài)顯色方法結(jié)果均一致。見表1。

表1 細(xì)胞治療產(chǎn)品熱原物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

3.4 T及CAR-T細(xì)胞對(duì)干擾試驗(yàn)的驗(yàn)證 試驗(yàn)結(jié)果見圖3-5。圖3結(jié)果表明，HL-60細(xì)胞CD19的表面抗原表達(dá)為陰性，應(yīng)與本試驗(yàn)中選擇的嵌合CD19抗原受體的T細(xì)胞（CAR-T細(xì)胞）無特異性結(jié)合作用。圖4鏡下觀察結(jié)果表明，T細(xì)胞偶見小的細(xì)胞團(tuán)塊（箭頭所示），CAR-T明顯可見大的細(xì)胞團(tuán)塊（箭頭所示）。圖5流式結(jié)果表明，T及CAR-T細(xì)胞分別與HL-60細(xì)胞孵育24 h，對(duì)HL-60細(xì)胞的凋亡率（早期凋亡加晚期凋亡）分別為5.67%及13.44%。

圖3 HL-60細(xì)胞CD19表達(dá)情況鑒定

圖4 T及CAR-T細(xì)胞對(duì)HL-60細(xì)胞的凋亡作用（顯微鏡觀察結(jié)果）

圖5 T及CAR-T細(xì)胞對(duì)HL-60細(xì)胞的凋亡作用（流式細(xì)胞儀結(jié)果）

4 討論

熱原檢測(cè)是保證非腸道用藥，特別是靜脈注射用藥質(zhì)量安全的重要檢測(cè)手段，近年來，各國(guó)相繼開展新的熱原檢測(cè)方法的研究，作為家兔法和細(xì)菌內(nèi)毒素法的替代和補(bǔ)充［9］。Wang C 等［5］首次報(bào)道 HL-60 細(xì)胞受熱原物質(zhì)刺激后，釋放可引起體內(nèi)發(fā)熱反應(yīng)的因子IL-6，靈敏度高，可用于定量檢測(cè)所有類型的致熱物質(zhì)，且無種屬差異。本試驗(yàn)建立HL-60/IL-6法，對(duì)相關(guān)影響因素做了研究，并選取部分細(xì)胞治療類產(chǎn)品進(jìn)行了適用性研究，證實(shí)本法可用于細(xì)胞治療類產(chǎn)品的熱原檢測(cè)。

細(xì)胞類治療產(chǎn)品是否具有適用性，關(guān)鍵在于干擾試驗(yàn)是否成立。對(duì)檢測(cè)所用細(xì)胞株（HL-60細(xì)胞）具有嚴(yán)重殺傷效果或抑制分泌功能的產(chǎn)品，均會(huì)對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生干擾作用［10］。從HL-60/IL-6法回收率結(jié)果看，所選產(chǎn)品的回收率均在50%～200%之間，不會(huì)產(chǎn)生干擾作用，本文進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞儀的方法更加直觀地驗(yàn)證了干擾試驗(yàn)的結(jié)果。從細(xì)胞產(chǎn)品作用機(jī)制分析，間充質(zhì)干細(xì)胞具備分化潛能，以修復(fù)受損肌體功能為主，對(duì)于HL-60細(xì)胞應(yīng)無直接殺傷或抑制作用；T及CAR-T細(xì)胞則具有直接的腫瘤細(xì)胞殺傷活性，存在結(jié)合并殺滅HL-60細(xì)胞、產(chǎn)生干擾作用的較大可能性，因此試驗(yàn)中僅選取T及CAR-T細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。本試驗(yàn)中用到的CAR-T細(xì)胞是嵌合CD19抗原受體的T細(xì)胞，對(duì)表達(dá)CD19的腫瘤細(xì)胞株有著特殊的靶向殺傷效果［11］。利用APC-CD19抗體檢測(cè)HL-60細(xì)胞表明其表面CD19抗體陰性表達(dá)，不會(huì)與CAR-T發(fā)生特異性結(jié)合。T細(xì)胞在發(fā)揮殺傷作用時(shí)，首先通過與靶細(xì)胞緊密結(jié)合，隨后釋放顆粒酶、穿孔素及Fas/FasL途徑導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡［2］。當(dāng)供試品稀釋8倍時(shí)，T細(xì)胞偶見細(xì)胞團(tuán)塊，CAR-T明顯可見細(xì)胞團(tuán)塊，但靶細(xì)胞凋亡率卻僅為5.67%及13.44%，均小于50%的限值要求，考慮細(xì)胞團(tuán)塊為高濃度下T及CAR-T細(xì)胞自身結(jié)合造成的團(tuán)塊，而對(duì)HL-60細(xì)胞無明顯影響。T細(xì)胞在發(fā)揮殺傷作用時(shí)，還需要抗原呈遞細(xì)胞CD3及CD28因子的共刺激活化作用，使細(xì)胞從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)［11］。企業(yè)生產(chǎn)的過程中，會(huì)加入含CD3及CD28的磁珠模擬體內(nèi)活化過程，但在生產(chǎn)結(jié)束時(shí)，考慮磁珠的安全性，會(huì)對(duì)磁珠進(jìn)行去除，因此形成終產(chǎn)品的T及CAR-T細(xì)胞很可能由于失去共刺激作用而處于靜息狀態(tài)，這可能是T及CAR-T細(xì)胞對(duì)HL-60細(xì)胞體外殺傷效果有限的原因。

綜上所述，HL-60/IL-6熱原檢測(cè)法無種屬性要求，靈敏度高，穩(wěn)定性好，方法可靠，能夠定量檢測(cè)細(xì)胞治療類產(chǎn)品中所含熱原物質(zhì)，作為生產(chǎn)廠家的內(nèi)控方法，成為該類品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的補(bǔ)充，更好地保障其臨床用藥安全。