覃婷婷，伏圣青，黃哲甦

（天津市藥品檢驗研究院，天津 300070）

眼氨肽制劑包括眼氨肽注射液和眼氨肽滴眼液，二者均以?；蜇i的動物眼球為原料，經(jīng)高濃度的乙醇提取等工藝制得眼氨肽提取液后，進一步滅菌或加抑菌劑經(jīng)無菌操作制得注射液或滴眼液，該類制劑主要用于治療角膜炎、視力疲勞及青少年假性近視［1-3］，臨床上也用于治療角膜上皮持續(xù)性缺損、干眼癥等眼科疾病［4-6］。眼氨肽制劑作為多組分提取藥物成分復雜，不僅含有多種氨基酸和多肽［7］，同時藥物中還可能殘留大分子蛋白［8］等容易引起過敏反應的物質(zhì)，筆者前期均進行了深入分析。此外，眼氨肽制劑的生產(chǎn)工藝采用高濃度的乙醇進行提取，提取液中會有乙醇殘留，另外部分眼氨肽滴眼液產(chǎn)品中加入的羥苯酯類抑菌劑使用乙醇作為溶劑，也可能使眼氨肽滴眼液終產(chǎn)品中殘留乙醇。乙醇殘留可導致急性中毒，因此，有必要控制眼氨肽制劑中乙醇的殘留量。目前眼氨肽注射液和眼氨肽滴眼液質(zhì)量標準均收載在《國家藥品標準化學藥品地方標準上升國家標準》第九冊中，均未對乙醇殘留量進行控制，存在著較大的風險隱患，且目前尚未見測定眼氨肽制劑中乙醇殘留量的相關報道。此次，筆者參考相應文獻［9-13］，采用頂空氣相色譜法并對其參數(shù)加以優(yōu)化，建立眼氨肽滴眼液、注射液中乙醇殘留量的測定方法，并對部分市售樣品進行監(jiān)測分析，以期為該類制劑的質(zhì)量監(jiān)管提供新的技術支撐，有助于推進眼氨肽制劑整體質(zhì)量評價標準體系的完善。

1 儀器與試藥

7980A氣相色譜儀（美國Agilent公司）；XS-204萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。眼氨肽滴眼液（A 公司，批號 160601、180201；B 公司，批號161001、161102、171004）；眼氨肽注射液（C 公司，批號57170701、58170703、57190301）；無水乙醇（天津康科德科技有限公司，色譜純，批號181226）；正丙醇（天津康科德科技有限公司，色譜純，批號170425），水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為CP-WAX 52 CB FS（50 m×0.32 mm，5 μm）毛細管柱；升溫程序：起始溫度為 70℃，維持8 min，以40℃/min速率升溫至200℃，維持10 min；進樣口溫度為200℃；檢測器為火焰離子化檢測器（FID）；檢測溫度為220℃；載氣為氮氣；流速為1.5 ml/min；分流比為 20∶1；頂空進樣量為 1 ml；頂空平衡溫度為85℃；頂空平衡時間為20 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標溶液 取正丙醇對照品適量，精密稱定，置內(nèi)盛水的量瓶中，并加水稀釋制成每1 ml含0.1 mg的溶液作為內(nèi)標溶液。

2.2.2 對照品溶液 取無水乙醇對照品適量，精密稱定，置內(nèi)盛水的量瓶中，并加水稀釋制成每1 ml含1mg的溶液作為對照品貯備液。精密量取1 ml，置內(nèi)盛水的50 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標溶液5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密量取本品5 ml，置內(nèi)盛水的50 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標溶液5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液 以水作為陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 分別精密量取陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液5 ml至20 ml頂空瓶中加蓋密封，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結(jié)果陰性對照無干擾，乙醇和正丙醇分離度大于1.5。見圖1。

圖1 對照品（A）供試品（B）陰性對照（C）GC色譜圖

2.4 線性關系考查 分別精密量取乙醇對照品貯備液 0.002、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2 和 1.5 ml至內(nèi)盛水的50 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標溶液5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，作為標準曲線溶液，分別精密量取上述溶液5 ml至20 ml頂空進樣瓶中，加蓋密塞，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，以乙醇濃度為橫坐標，乙醇與正丙醇峰面積比值為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果在0.4～303.4 μg/ml濃度范圍內(nèi)，乙醇與內(nèi)標峰面積比值與乙醇濃度呈良好線性關系，線性方程為Y=0.005 4X-0.005 7（r=0.999 9）。

2.5 精密度試驗 精密量取對照品溶液5 ml至20 ml頂空瓶中加蓋密封，同法制備6份，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣分析，記錄乙醇與正丙醇峰面積比值，RSD為1.35%。

2.6 重復性試驗 取同一批供試品（批號160601）照“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別精密量取上述溶液5 ml至20 ml頂空瓶中，按“2.1”項下色譜條件進樣分析進樣分析，乙醇平均殘留量為0.81 mg/ml，RSD為0.53%。

2.7 加樣回收率試驗 取同一批供試品（批號160601），精密量取供試品2.5 ml，置內(nèi)盛水的50 ml量瓶中，平行制備9份，分別精密加入對照品貯備液0.15、0.20和0.25 ml各3份，再精密加入內(nèi)標溶液5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，作為加樣回收溶液。分別精密量取上述溶液5 ml至20 ml頂空瓶中，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結(jié)果乙醇平均回收率為100.28%，RSD為1.80%。見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.8 檢出限和定量限試驗 精密量取乙醇對照品貯備液用水逐步稀釋，精密量取上述溶液5 ml至20 ml頂空進樣瓶中，加蓋密塞，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，當信噪比為3∶1時，檢出限為0.1 μg/ml；當信噪比為 10∶1 時，定量限為 0.4 μg/ml。

2.9 樣品中乙醇殘留量測定 取5批眼氨肽滴眼液和3批眼氨肽注射液照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液5 ml至20 ml頂空瓶中，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，以內(nèi)標法計算樣品中乙醇殘留量，結(jié)果見表2。

表2 樣品中乙醇殘留量測定結(jié)果

3 討論

3.1 方法的選擇 眼氨肽制劑為多組分生化藥物，成分復雜，如選擇溶液直接進樣法測定乙醇，可能會對測定造成干擾，且對儀器進樣口和色譜柱造成損害，故本研究采用頂空進樣法，只測定揮發(fā)性成分，干擾少，分離度好。

3.2 頂空溫度的選擇 本研究分別考查了75、80、85和90℃的頂空平衡溫度，結(jié)果顯示，隨著溫度的上升，乙醇和正丙醇的峰面積均增大，樣品在上述溫度的頂空條件下，乙醇峰面積與正丙醇峰面積比值變化不大，在85℃時比值達最大值，因此選擇85℃作為頂空平衡溫度。

3.3 頂空平衡時間的選擇 本試驗分別考查了10、20和30 min的頂空平衡時間，結(jié)果顯示，乙醇峰面積與正丙醇峰面積比值在10 min后變化不大，在20 min時，乙醇峰面積與正丙醇峰面積均達到最大值，故選擇20 min作為頂空平衡時間。

3.4 乙醇殘留量監(jiān)測的意義 按照《中國藥典》2015年版通則［14］0861殘留溶劑測定法的要求，乙醇為第三類溶劑，應按藥品GMP或其他質(zhì)量要求加以限制使用，并將其限量定為0.5%。本文建立了簡便、準確的方法用于測定眼氨肽制劑的乙醇殘留量，并對市售的5批眼氨肽滴眼液和3批眼氨肽注射液樣品進行了檢測，結(jié)果均檢出乙醇，測定結(jié)果在0.03%～0.1%之間，未超過0.5%，符合《中國藥典》要求。不過，本次檢測樣品數(shù)量較為有限，考慮到乙醇殘留可導致急性中毒，建議企業(yè)及藥檢部門有必要在日常工作中重視對眼氨肽制劑中乙醇殘留量的監(jiān)測與控制。