劉軍艦，李忠廉，尚海濤

阻塞性黃疸是臨床常見病、多發(fā)病，多因膽結(jié)石、膽道閉塞、腫瘤壓迫等膽管機械性梗阻導(dǎo)致膽汁淤積所致，可引起肝組織、膽管等全身系統(tǒng)的一系列病理變化［1］。膽汁排泄受阻引起膽汁酸在肝細胞內(nèi)淤積，疏水性膽汁酸淤積可以通過炎癥反應(yīng)機制、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、死亡受體途徑等損傷肝細胞［2］。如何有效地減少病理條件下疏水性膽汁酸對肝細胞的毒性作用是一個亟需解決的問題。中醫(yī)治療黃疸歷史悠久，臨床以茵陳蒿湯隨證加減，已廣泛用于肝膽系統(tǒng)疾病及藥物所致的肝臟損害，特別是對各種熱郁于里，濕無出路，濕熱蘊結(jié)所致黃疸的治療，顯示出良好的療效。但茵陳蒿湯對于阻塞性黃疸疾病的多靶點、多途徑、多效應(yīng)的作用機制尚未十分明確。筆者對阻塞性黃疸大鼠肝細胞線粒體DNA（mtDNA）的損傷情況進行了定量研究，旨在探討其變化與膽汁酸代謝的相互關(guān)系，以及中藥茵陳蒿湯對其調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 提取試劑：基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型，TIANGEN生物公司）；實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒：Super Real Premix（SYBR Green）試劑盒（TIANGEN生物公司）。電泳儀（北京六一儀器廠）；電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；凝膠成像儀（培清科技JS-680B凝膠成像儀）；分光光度計：NANODROP 1000（Thermo 公司）；qPCR儀：ABI7500（ABI 公司）；生化分析儀：新銳全自動生化分析儀XR220PLUS（中山市新銳醫(yī)療設(shè)備科技有限公司）；小動物專用吸入麻醉機：VIP 3000（美國Matrx）。

1.2 實驗動物及分組 成年SD大鼠54只，體質(zhì)量200～230 g，雄性，SPF級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司（實驗動物使用許可證號：SCXK 京2014-0004；動物倫理委員會通過編號：NKYY-DWLL-2019-081），委托天津市急腹癥器官損傷與中西醫(yī)修復(fù)重點實驗室動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)管理嚴格按照本中心制定的實驗動物中心操作規(guī)程（SOP）進行。

1.3 中藥方劑 依據(jù)《傷寒論》中茵陳蒿湯劑量組成折合：茵陳180 g，桅子150 g，大黃60 g，共計390 g［3］。中藥購于天津市南開醫(yī)院中藥制劑室，先用冷水浸泡30 min，煎煮2次，第1次45 min，第2次30 min，取2次煎煮液濃縮至390 mL，每mL含生藥量1 g。

1.4 動物分組、造模及給藥方法 應(yīng)用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、茵陳蒿湯組，每組18 只。造模方法為：術(shù)前12 h禁食水，2.5%維持濃度的異氟烷吸入麻醉后消毒，上腹正中切口入腹。以幽門部為標(biāo)準，翻轉(zhuǎn)引出十二指腸乳頭部，再追蹤膽總管，在肝門處分離出膽總管；模型組和茵陳蒿湯組于膽總管中上1/3 行雙重結(jié)扎，手術(shù)24 h 后觀察大鼠小便顏色變黃即說明膽道梗阻性黃疸模型建立成功。假手術(shù)組游離上段膽總管后關(guān)腹。大鼠自建模后第3天起茵陳蒿湯組每日給予茵陳蒿湯劑（相當(dāng)于生藥1 g/mL）3.6 mL/kg灌胃，假手術(shù)組和模型組每日給予等量生理鹽水灌胃。觀察時點為梗阻建模后第1、3、8天。

1.5 標(biāo)本留取及檢測指標(biāo) 每時點各組處死大鼠6只，留取肝組織以備qPCR檢測。建模后第8天用代謝籠留取6 h尿，記錄尿量變化情況，留取血液標(biāo)本，檢測血總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、血清總膽汁酸（TSBA），尿總膽汁酸（TUBA）。

1.6 大鼠肝組織mtDNA 相對量檢測 取大鼠肝組織1 g，將其剪成細小碎粒狀，放入Eppendorf管中，應(yīng)用堿裂解法裂解組織細胞，離心后取上清液，應(yīng)用氯仿異戊醇直接提取mtDNA。因ND1 基因片段為mtDNA 高保守序列，故其可以反映DNA 模板中mtDNA 的總量，以β-actin 基因作為管家基因。運用Premier 5.0 和Oligo 6 軟件進行引物設(shè)計。ND1 引物序列 ：上 游 5′-GGCTACATACAATTACGCAAG-3′，下 游 5′-TAGAATGGAGTAGACCGAAAGG-3′，產(chǎn)物大小 267 bp；βactin 引物序列：上游 5′-ATCCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下 游 5′-GGCTACAACTACAGGGCTGACCAC-3′，產(chǎn)物大小177 bp。PCR 體系為SYBR GreenⅠ體系，DNA 模板2 μL（約100 μg），上下游引物各0.4 μL（終濃度0.2 μmol/L），H2O 7.2 μL，總反應(yīng)體積10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 20 s，退火 55 ℃，20 s，延伸 72 ℃ 30 s，32 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)梯度稀釋的PCR 產(chǎn)物繪制標(biāo)準曲線，應(yīng)用Sequence Detector System Version 1.3.1 軟件（Applied Biosystems）進行數(shù)據(jù)處理。目的基因的相對表達量=2-ΔΔCt。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用IBM SPSS Statistics 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT、GGT 水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組TBIL、DBIL、ALT、GGT升高；與模型組比較，茵陳蒿湯組TBIL、DBIL、ALT、GGT均有所改善，見表1。

Tab.1 The serum contents of TBIL,DBIL,ALT and GGT in three groups of rats表1 3組大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和GGT含量（n=6，）

Tab.1 The serum contents of TBIL,DBIL,ALT and GGT in three groups of rats表1 3組大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和GGT含量（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05；表2同

組別假手術(shù)組模型組茵陳蒿湯組F TBIL（μmol/L）1.55±0.12 174.04±27.23a 135.67±16.79ab 150.288＊＊DBIL（μmol/L）0.65±0.14 141.30±12.77a 110.50±10.96ab 344.534＊＊ALT（U/L）63.53±11.41 422.26±56.78a 284.15±39.84ab 126.096＊＊GGT（U/L）1.02±0.06 42.30±6.75a 27.05±3.89ab 123.930＊＊

2.2 3 組大鼠血、尿中TBA 與尿量的比較 與假手術(shù)組比較，模型組血、尿TBA均升高，尿量下降；與模型組比較，茵陳蒿湯組血TBA 下降，而尿TBA 及尿量升高，見表2。

Tab.2 The serum and urine contents of TBA and urine volumes in three groups of rats表2 3組大鼠血、尿中TBA、尿量比較 （n=6，）

Tab.2 The serum and urine contents of TBA and urine volumes in three groups of rats表2 3組大鼠血、尿中TBA、尿量比較 （n=6，）

組別假手術(shù)組模型組茵陳蒿湯組F血TBA（μmol/L）21.43±2.01 334.04±41.08a 223.66±31.55ab 160.289＊＊尿TBA（μmol/L）1.21±0.32 281.56±43.00a 389.59±65.79ab 118.626＊＊尿量（mL）8.92±0.93 3.49±1.45a 6.01±1.77ab 22.759＊＊

2.3 3 組大鼠肝細胞mtDNA 相對表達量比較 與假手術(shù)組比較，模型組與茵陳蒿湯組mtDNA相對表達量于各時間點均減少；模型組mtDNA相對表達量進行性減少；茵陳蒿湯組mtDNA 的相對表達量第8天較第3天回升，見表3。

Tab.3 The relative quantity of mtDNA in three groups表3 3組大鼠mtDNA相對表達量 （n=6，）

Tab.3 The relative quantity of mtDNA in three groups表3 3組大鼠mtDNA相對表達量 （n=6，）

＊＊P＜0.01；A 與前一時間點比較，P＜0.05；a 與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b與模型組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組茵陳蒿湯組F第1天1.03±0.12 0.68±0.10a 0.64±0.09a 23.388＊＊第3天1.08±0.11 0.39±0.08Aa 0.35±0.07Aa 135.362＊＊第8天1.09±0.16 0.27±0.06Aa 0.73±0.11Aab 75.959＊＊F 0.439 41.922＊＊27.408＊＊

3 討論

中醫(yī)理論認為黃疸形成的關(guān)鍵是濕、熱二邪，病位上，黃疸的病位主要在脾胃肝膽，黃疸病證基本病機是濕熱瘀濁阻滯，膽液不循常道外溢而發(fā)黃。針對濕熱內(nèi)阻致黃的病機，張仲景提出“諸病黃家，但利其小便”的治療原則。清熱利濕之茵陳蒿湯為退黃代表方劑之一，其服用方法中提到“分溫三服，小便當(dāng)利，尿如皂角汁狀，色正赤。一宿腹減，黃從小便去也”。筆者認為茵陳蒿治療黃疸治法上運用“利其小便”之法，起到疏肝利膽、清熱利濕的功效，使“黃從小便去”。本研究顯示，膽道阻塞發(fā)生后，模型組TBIL、DBIL、ALT、GGT 升高，茵陳蒿湯組大鼠的上述指標(biāo)較模型組均改善，提示茵陳蒿湯對阻塞性黃疸大鼠肝功能及黃疸指標(biāo)有改善作用。

阻塞性黃疸發(fā)生后，疏水性膽汁酸淤積在肝損害中扮演重要角色，是導(dǎo)致肝細胞損傷、凋亡或壞死的主要因素之一［4］。正常情況下，僅有少量膽汁酸可從肝細胞中逃逸，經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)由腎過濾到尿液中［5］。阻塞性黃疸發(fā)生時，正常的膽汁肝-腸循環(huán)遭到阻斷，此時腎臟對膽汁酸的“替代性途徑”排泄作用尤為重要［6］。本研究顯示，模型組大鼠血TBA 升高，同時尿TBA含量也升高，提示腎臟的排泄可能成為此時膽汁酸的主要消除途徑，這與Krones 等［7］的研究結(jié)果一致。茵陳蒿湯復(fù)方中含有與膽汁酸代謝有關(guān)的多種活性成分，如β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山萘酚以及異鼠李素等［8］。Cai 等［9］認為這些生物活性成分可以調(diào)節(jié)膽汁酸的合成及代謝途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，給予茵陳蒿湯治療的大鼠，循環(huán)血膽汁酸含量下降，尿量及尿膽汁酸含量均增加。因此筆者認為，茵陳蒿湯可以通過替代性途徑來增強膽汁酸的排泄，增加膽汁酸的尿液排泄，降低循環(huán)血總膽汁酸。但本研究并未檢測茵陳蒿湯調(diào)節(jié)膽汁酸代謝的調(diào)控因子表達情況，相關(guān)通路具體作用機制有待進一步研究證實。

線粒體是阻塞性黃疸時肝細胞內(nèi)最先受損害的細胞器，而線粒體功能是決定肝細胞功能的重要因素［10］。Arab等［2］認為疏水性膽汁酸在肝細胞內(nèi)淤積對線粒體結(jié)構(gòu)和功能有明顯損害作用。ND1DNA定位于mtDNA（堿基序列3307～4263），相對保守的特點使研究者可以通過檢測ND1 DNA 量的變化來反映mtDNA的變化情況。本研究顯示，模型組肝組織mtDNA的量隨膽道阻塞時間延長而進行性減少，茵陳蒿湯組在給與茵陳蒿湯治療后mtDNA 的量逐漸回升，提示茵陳蒿湯對阻塞性黃疸大鼠肝細胞mtDNA起保護作用。

綜上所述，筆者認為茵陳蒿湯可以通過替代性途徑來增強膽汁酸的排泄，增加膽汁酸的尿液排泄，降低循環(huán)血總膽汁酸，茵陳蒿湯可能通過肝-腎軸途徑調(diào)節(jié)膽汁酸代謝以減少肝細胞mtDNA損傷，進而改善阻塞性黃疸大鼠肝功能。