楊鄭州，侯保朝，謝曉娜，郭炳豪

（百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西百色533000）

0 引 言

近年來(lái)，微生態(tài)制劑作為一種新興的保健品，對(duì)增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)宿主健康起到了一定的作用，由于它的安全無(wú)副作用，已被大多數(shù)人所肯定[1-2]。當(dāng)益生菌（probiotics）黏附于宿主腸道內(nèi)時(shí)，對(duì)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)失調(diào)、促進(jìn)機(jī)體免疫功能、發(fā)揮其益生功能特性起著重要的作用。黏附性能作為益生菌的重要特點(diǎn)之一，已被越來(lái)越多的學(xué)者所重視[3]。Collins 等提出確定益生菌株的標(biāo)準(zhǔn)是，益生菌黏附和定植于宿主腸道的能力，因?yàn)橐嫔瓯仨殞?duì)上皮細(xì)胞組織具有黏附性才能長(zhǎng)期在腸道中存活并發(fā)揮其作用[4]。

副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）作為益生菌可應(yīng)用于食品以及營(yíng)養(yǎng)保健品中，它能黏附于宿主腸道上皮細(xì)胞上，保證了其發(fā)揮益生功能[5-6]。國(guó)內(nèi)外的一些研究表明，乳酸菌通過(guò)黏附素與腸黏膜上皮細(xì)胞受體黏附，維持腸道菌群平衡及發(fā)揮益生功能，對(duì)于維護(hù)胃腸道正常的生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定起重要作用[7-8]。因此，基于基因組學(xué)注釋乳酸菌黏附作用相關(guān)基因并探究其黏附作用，將為研究乳酸菌的益生功能提供新的理論基礎(chǔ)。本課題選用分離自西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的L. paracasei 作為乳酸菌的代表，篩選出高黏附性能的目標(biāo)菌株，利用GO 分類篩選Human Genome U133 Plus 2.0 Array 基因表達(dá)譜芯片中的黏附相關(guān)基因，同時(shí)通過(guò)研究去除L. paracasei 表面黏附素對(duì)黏附性的影響情況，并研究其對(duì)病原菌黏附的抑制作用，為深入揭示益生菌黏附機(jī)制奠定重要基礎(chǔ)，也為微生態(tài)制劑的研發(fā)與生產(chǎn)提供了深層次的理論依據(jù)，具有重要的科學(xué)理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20 株分離自西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的L. para?casei；大腸桿菌（Escherichia coli）K 8，丹麥丹尼斯克公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所；Trizol Reagent，Invitrogen 公司；DMEM，GIB?CO 公司；青霉素、鏈霉素，大連美羅大藥廠；PBS 磷酸鹽緩沖液、焦碳酸二乙酯（DEPC）、MRS 培養(yǎng)基，北京索萊寶生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 快速提取試劑盒，BioTeKe公司；胎牛血清、胰蛋白酶消化液，TBD 公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板，Orange公司。

1.2 儀器與設(shè)備

各種規(guī)格 Eppondorf 移液器、HF90 型 CO2培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司；AE31 型倒置顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；BCN1360 型生物潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造；低溫冷凍離心機(jī)，上海離心機(jī)械研究所；微量臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)Beck?man 公司；快速混勻器，姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；Model 680 酶標(biāo)儀，美國(guó) Beckman 公司；YDS-10 型液氮罐，成都金鳳液氮容器有限公司；DH-101 恒溫鼓風(fēng)干燥箱，青島海爾集團(tuán)公司；電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高黏附性能菌株的篩選

將活化后活菌數(shù)為1×107CFU/mL 的1 mL 菌液在 4 ℃ 條件下 10 000 r/min 離心 5 min，經(jīng)無(wú)菌 PBS 緩沖液洗滌兩次后重懸于DMEM 高糖培養(yǎng)液。將Ca?co-2 細(xì)胞接種于六孔板中，于加菌前24 h 更換不含青鏈霉素的細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞培養(yǎng)至極化狀態(tài)并加入含菌細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)2 h，每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)平行。共培養(yǎng)后，使用PBS緩沖液沖洗掉未黏附上的菌體，胰酶消化收集細(xì)胞并稀釋涂布，在37 ℃條件下置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，平板計(jì)數(shù)。以黏附率為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選出高黏附性能的目標(biāo)菌株，黏附率公式如下所示：

黏附率 (%) = 100× lg 黏附的菌落數(shù)(CFU) / lg 加入的菌落數(shù)(CFU)

1.3.2 黏附基因的注釋

本實(shí)驗(yàn)中采用Affymetrix 公司的U133 Plus 2.0 表達(dá)譜芯片，由上海生物芯片有限公司-生物芯片上海國(guó)家工程研究中心提供。通過(guò)GO 分類分析基因芯片中的黏附相關(guān)基因。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)是：基因變化（change）為I 或MI，log ratio≥1，實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)值（De?tection）為P 的為上調(diào)基因；change 為D 或MD，log ra?tio≤-1，Detection為P 的為下調(diào)基因。

1.3.3 掃描電鏡觀察處理菌體的情況

將經(jīng)過(guò)菌體黏附實(shí)驗(yàn)后的細(xì)胞先用2.5%（v/v）的戊二醛4 ℃固定1.5 h。固定后與經(jīng)過(guò)酶和化學(xué)法處理過(guò)的目標(biāo)菌株一起用0.1mol/L pH7.2 的磷酸鹽沖洗兩次，每次10min。分別用50%、70%、90%、100%的乙醇脫水兩次，每次10～15min。用100%乙醇∶叔丁醇=1∶1 的溶液以及純叔丁醇處理樣品各一次，每次15 min。冷凍干燥4 h。掃描電鏡觀察經(jīng)過(guò)酶和化學(xué)法處理過(guò)的目標(biāo)菌株。

1.3.4 處理的菌體對(duì)Caco-2細(xì)胞黏附影響

Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，PBS 緩沖液洗2 次，胰酶消化，用DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×104個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)15 d 后用無(wú)抗生素的PBS 緩沖液漂洗2 次，每孔分別加入1 mL DMEM 培養(yǎng)液及1 mL 處理過(guò)的目標(biāo)菌株，在37 ℃下，含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)共同培養(yǎng)2 h。PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗5 次。進(jìn)行革蘭氏染色。進(jìn)行鏡檢，隨機(jī)讀取20 個(gè)視野100 個(gè)細(xì)胞黏附的總菌數(shù)，其值即為每100 個(gè)細(xì)胞上黏附菌數(shù)的平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）。

1.3.5 對(duì)病原菌黏附的抑制作用

在96 孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL。設(shè)置三個(gè)組別分析對(duì)病原菌的競(jìng)爭(zhēng)、排斥以及置換作用。競(jìng)爭(zhēng)組是將Caco-2 細(xì)胞、目標(biāo)菌和經(jīng)過(guò)FITC 標(biāo)記的大腸桿菌（Escherichia coli）K 8 在37 ℃厭氧條件下共同孵育1 h；排斥組將Caco-2 細(xì)胞和目標(biāo)菌在厭氧條件下共孵育1 h 后，1 000 r/min 離心去上清，再加入經(jīng)FITC 標(biāo)記的E. coli K 8 共孵育1 h。置換組是將Ca?co-2 細(xì)胞和經(jīng)FITC 標(biāo)記的E. coli K 8 厭氧條件下共孵育1 h 后，離心去上清后再加入目標(biāo)菌，厭氧條件下共孵育1 h。三組樣品孵育完成后，1 000 r/min 離心去上清。使用PBS洗滌沉淀3次后，用PBS重懸至黑色的96 孔板，避光靜置2 h。每個(gè)培養(yǎng)孔中加入0.1 mL胰酶作用5 min，待細(xì)胞完全脫落，加入0.4 mL 胰酶使培養(yǎng)液終止反應(yīng)。收集液體，用酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度，每組設(shè)置6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)孔為1 個(gè)重復(fù)。黏附率公式如下所示：

黏附率(%) = 100×A2/A1

式中：A1為無(wú)目標(biāo)菌存在的情況下，黏附在Ca?co-2 細(xì)胞上的E. coli K 8 相對(duì)熒光強(qiáng)度；A2為存在目標(biāo)菌的情況下，黏附在Caco-2 細(xì)胞上的E. coli K 8 相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)及方差分析（ANOVA），檢測(cè)差異顯著性結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高黏附性能菌株的篩選

乳酸菌是一類能夠維持腸道微生態(tài)平衡，對(duì)宿主起有益作用的益生菌。乳酸菌必須黏附于宿主腸道細(xì)胞，才能與正常菌群一起構(gòu)成生物屏障，通過(guò)定植保護(hù)作用發(fā)揮生理功能[9]。目前國(guó)內(nèi)外常用體外模型來(lái)檢測(cè)乳酸菌黏附于腸道的能力[10]。Caco-2 細(xì)胞是體外研究乳酸菌黏附性能的最常見(jiàn)的模式細(xì)胞[11]，具有與小腸相同的維持細(xì)胞極性的重要結(jié)構(gòu)（如微絨毛和緊密連接等），能表達(dá)正常人腸細(xì)胞的形態(tài)和某些生理特征。

如圖1 所示，分離自西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的20 株 L. paracasei 均能黏附于 Caco-2 細(xì)胞，不同菌株的黏附水平之間存在差異性，L. paracasei BS 08 黏附能力顯著高于其他L. paracasei 菌株，表明乳酸菌對(duì)腸道細(xì)胞黏附有種屬及菌株特異性。有研究報(bào)道，甘露糖和Ca2+在一些乳酸菌的黏附過(guò)程中起重要作用，乳酸菌細(xì)胞壁中的脂磷壁酸以及乳酸菌發(fā)酵液中菌體分泌的某些蛋白也能促進(jìn)乳酸菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附[12]。本實(shí)驗(yàn)采用的是培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L. paracasei 菌株，各菌株均具有黏附能力，說(shuō)明L. paracasei 對(duì)Ca?co-2 細(xì)胞的黏附不是或不完全是由發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)介導(dǎo)的，具體的黏附機(jī)理還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 20株L.paracasei 的黏附率

2.2 黏附作用基因分析

本研究所用的人基因表達(dá)譜芯片涵蓋47 000 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，代表38 500 個(gè)人類基因。通過(guò)該芯片雜交檢測(cè)了 L. paracasei BS 08 與 Caco-2 細(xì)胞作用 2 h 后的基因表達(dá)變化，根據(jù)GO 分類標(biāo)準(zhǔn)，將得到的差異表達(dá)基因分為24 類。其中有18 個(gè)涉及黏附作用的相關(guān)基因（見(jiàn)表1）。

通過(guò)比對(duì)可知，L. paracasei BS 08 的基因組中存在18 個(gè)與黏附相關(guān)的基因。黏附相關(guān)基因均屬于黏附相關(guān)的分子家族，如整合素家族、免疫球蛋白超家族、選擇素家族、黏蛋白樣血管地址素、黏著素或鈣離子依賴的細(xì)胞黏附分子家族等[13]。上述18 個(gè)基因中的prgB/asc10、EF0485、EF0149、Asa1、efaA、Ace、srtC、ebpC、ebpB、lap、esp、clpC 均屬于免疫球蛋白超家族，是淋巴細(xì)胞抗原的配基，也可與CD6和NgCAM 等蛋白結(jié)合[14]。而clpC 既是整合素家族中白細(xì)胞黏附受體組的配體，又同時(shí)屬于免疫球蛋白超家族。還有錳離子依賴或與整合素家族相互作用的細(xì)胞黏附分子。

2.3 掃描電鏡觀察處理后的菌體形態(tài)

黏附素是存在于微生物的菌毛、細(xì)胞壁、外膜蛋白、鞭毛、莢膜及小絲狀體的一類與微生物的黏附密切相關(guān)的特殊物質(zhì)，可能是蛋白質(zhì)、多肽、糖蛋白、糖脂和多糖或單糖，是一種具有多種結(jié)構(gòu)和功能的多樣化分子。許多研究表明菌體的表面成分，即表面蛋白，胞外多糖和磷壁酸，是影響菌體與細(xì)胞之間黏附的黏附素。而之前的研究大多關(guān)注去除這些菌體表面黏附素后，利用體外黏附模型觀察菌體黏附細(xì)胞數(shù)的增減[15]。乳酸桿菌和宿主腸上皮細(xì)胞的黏附已經(jīng)被證實(shí)與乳酸菌體表面成分作用有關(guān)，如胞外多糖（exopolysaccharides, EPS）、脂磷壁酸（lipoteichoic acid,LTA）和表面蛋白（surface layer protein, SLP）等，其中表面蛋白起著關(guān)鍵性的作用[16]。

由圖 2 d 可以看出，L. paracasei BS 08 為桿狀，表面平滑，處理組與非處理組并無(wú)明顯差異。無(wú)處理組的菌體長(zhǎng)度大約為3.3 μm，經(jīng)過(guò)處理以后L. paracasei BS 08的菌體長(zhǎng)度分別約為3.2 μm（圖2 a），3.5 μm（圖2 b）和3.5 μm（圖2 c），所以經(jīng)過(guò)處理以后并沒(méi)有引起菌體表面出現(xiàn)異常形態(tài)或者造成菌體的斷裂。但是我們可以較明顯的看到，三個(gè)處理組中的菌體都呈聚集狀態(tài)，而無(wú)處理組的菌體都是獨(dú)立存在的，說(shuō)明三種處理都會(huì)增加菌體表面的黏性。

表1 黏附作用相關(guān)基因

圖2 掃描電鏡（×5000）下觀察處理后的L. paracasei BS 08的形態(tài)特征

2.4 L. paracasei BS 08對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力

隨機(jī)選取20 個(gè)視野，記錄100 個(gè)細(xì)胞黏附的菌體總數(shù)（見(jiàn)圖3）。從圖中可以看出，在去表面蛋白組和去胞外多糖組中，菌體與細(xì)胞的黏附數(shù)都顯著低于無(wú)處理組（P<0.01），說(shuō)明表面蛋白和胞外多糖都是影響菌體與細(xì)胞之間黏附的主要因素。對(duì)于兩個(gè)處理組之間的比較可以看出，去表面蛋白組的黏附數(shù)顯著地低于去胞外多糖組（P<0.01），說(shuō)明表面蛋白對(duì)菌體與細(xì)胞黏附的影響顯著地大于胞外多糖。

圖3 化學(xué)和酶處理對(duì)L.paracasei BS 08 黏附Caco-2 細(xì)胞的影響（×400）

乳酸菌表面存在SLP，這種蛋白呈單分子晶體排列結(jié)構(gòu)，具有方形或六邊形對(duì)稱結(jié)構(gòu)，與菌體黏附腸上皮細(xì)胞有關(guān)[17-18]。乳酸菌分泌的胞外多糖可以提高菌株對(duì)腸道表面的非特異性黏附能力，研究顯示乳酸菌合成的胞外多糖與細(xì)菌聚集有密切的聯(lián)系，細(xì)菌聚集是生物膜形成的一個(gè)整合的過(guò)程，而生物膜的形成對(duì)黏附有推動(dòng)作用[19]。此研究去除菌體表面蛋白，去表面蛋白組與對(duì)照組相比黏附數(shù)顯著減少，說(shuō)明L.paracasei BS 08 的表面蛋白在菌體與細(xì)胞黏附的過(guò)程中確實(shí)起到了重要的作用。且去除菌體表面的胞外多糖后，能顯著減低菌體與細(xì)胞之間的黏附，說(shuō)明L.paracasei BS 08 的胞外多糖對(duì)菌體與細(xì)胞之間的黏附起到了一定的作用，但是不如去表面蛋白組黏附作用效果顯著。從掃描電鏡的圖中我們也可以看出，菌體在去除胞外多糖后聚集成塊，而非處理組的菌體獨(dú)立存在，也證明了胞外多糖與細(xì)菌的聚集有一定的聯(lián)系。

2.5 L.paracasei BS 08對(duì)病原菌黏附作用的影響

對(duì)于益生菌的作用機(jī)理，黏附是其發(fā)揮益生作用的前提，經(jīng)過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)L. paracasei BS 08 對(duì)Caco-2細(xì)胞有極強(qiáng)的黏附力，而且L. paracasei BS 08 能顯著降低E. coli K 8 對(duì)Caco-2 細(xì)胞的侵襲能力和結(jié)合能力（見(jiàn)圖4）。本研究發(fā)現(xiàn)L. paracasei BS 08 能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、排斥、置換作用顯著抑制E. coli K 8 對(duì)Caco-2 細(xì)胞的黏附作用。雖然不同乳酸菌對(duì)腸道致病菌的黏附抑制作用機(jī)制不同，但是很多乳酸菌抑制腸致病菌黏附腸上皮細(xì)胞都是通過(guò)排斥、競(jìng)爭(zhēng)或置換作用實(shí)現(xiàn)[20]。

L. paracasei BS 08 黏附于腸上皮細(xì)胞的過(guò)程中，它作為一種細(xì)胞外的刺激因素必然會(huì)引起靶細(xì)胞的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)，啟動(dòng)靶細(xì)胞內(nèi)的生理生化反應(yīng)過(guò)程。一般認(rèn)為，腸致病性大腸桿菌（EPEC）的黏附過(guò)程中通過(guò)1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）受體系統(tǒng)而觸發(fā)胞內(nèi)鈣儲(chǔ)池釋放Ca2+，啟動(dòng)蛋白磷酸化反應(yīng)，引起腸上皮細(xì)胞刷狀緣微絨毛局部變性，細(xì)胞與EPEC 黏附接觸處的細(xì)胞骨架聚集，胞膜形成杯狀結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的18 個(gè)黏附相關(guān)基因所編碼的蛋白可能是L. paracasei BS 08 的黏附受體，通過(guò)與菌體的相互作用刺激細(xì)胞的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制病原菌對(duì)宿主的黏附作用。

圖4 L.paracasei BS 08對(duì)E.coli K 8黏附到Caco-2細(xì)胞的影響

3 結(jié) 論

通過(guò)比較20 株分離自西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的L.paracasei 菌株對(duì)Caco-2 細(xì)胞的黏附性能，發(fā)現(xiàn)黏附性具有菌株特異性，篩選出高黏附性能的L. paracasei BS 08 為目標(biāo)菌株。在通過(guò)化學(xué)和酶處理去除表面黏附素后，菌體表面并未出現(xiàn)異常；L. paracasei BS 08 能黏附于Caco-2 細(xì)胞的周圍和表面，并且黏附能力良好。而去表面蛋白組和去胞外多糖組都引起菌體黏附數(shù)的顯著下降，去表面蛋白組引起菌體黏附數(shù)的下降顯著地低于去胞外多糖組，說(shuō)明表面蛋白對(duì)菌體的黏附影響更明顯。通過(guò)基因芯片分析注釋到了18 個(gè)黏附相關(guān)基因，包括 prgB/asc10、EF0485、EF0149、Asa1、efaA、Ace、srtC、ebpC、ebpB、lap、esp、clpC 等，并且L. paracasei BS 08 可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、排斥和置換三種方式對(duì)病原菌E. coli K 8 的黏附具有顯著地抑制作用。此研究為深入揭示益生菌黏附機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為開(kāi)發(fā)應(yīng)用微生物制劑提供理論參考。