黨慧杰，鄭遠榮，劉振民，龐佳坤，包怡,3，姜姝,3

（1. 乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海200436；2.上海海洋大學食品學院，上海201306；3.上海大學生命科學學院，上海200444）

0 引 言

牛乳蛋白(Cow milk proteins, 乳蛋白)營養(yǎng)豐富，幾乎含有人體所有的必需氨基酸，在嬰幼兒的生長發(fā)育中起著較為重要的作用[1]。其組成接近人乳，但在含量上存在一定差異，部分人群可能會因為攝入而出現(xiàn)皮膚、胃腸道或呼吸等方面的疾病[2]，還可能涉及多個靶器官，導(dǎo)致復(fù)雜的全身過敏反應(yīng)，可能引發(fā)死亡風險[3]。這是典型的由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的食物過敏現(xiàn)象，牛乳過敏是嬰幼兒常見的食物過敏，患病率報道不一，約為2%～7.5%[4-5]。

目前，還沒有牛乳過敏的治療方法，若確診過敏，只有通過完全避食預(yù)防[6]。然而，總是避免牛乳及其制品的攝入可能會導(dǎo)致營養(yǎng)不良，甚至影響嬰幼兒生長。為了解決這一問題，已有眾多學者研究了蛋白質(zhì)改性技術(shù)[7-9]來消減乳蛋白的致敏性。其中酶解改性應(yīng)用較為成熟[10-12]，酶催化大分子的蛋白質(zhì)水解成為小分子肽和氨基酸，破壞過敏原蛋白的線性或空間構(gòu)象，從而顯著降低其致敏性[13]。而且，還具有省時、經(jīng)濟，有功能新肽的產(chǎn)生等優(yōu)點[14]，在工業(yè)上已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)低致敏嬰兒配方乳粉，如市售的部分或深度水解配方乳粉。但是，部分水解配方乳粉可能含有乳蛋白致敏片段殘留[15]。深度水解配方乳粉則大都存在風味差，乳化性不好等缺點[16]。隨著研究的深入，酶結(jié)合其他先進的預(yù)處理技術(shù)應(yīng)用到了降低牛乳及其制品的致敏性中，以更優(yōu)的口感、營養(yǎng)和功效而被廣泛研究，具有較好的應(yīng)用前景。

1 牛乳蛋白致敏機制

食物過敏是指人體對外來抗原的異常免疫反應(yīng)[17]，食物中能夠引起機體免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)的成分即為食物過敏原，一般為蛋白質(zhì)。乳蛋白約占牛乳的3%[18]，至少有25 個不同種類，且都可能作為過敏原[3]。其中，最主要的過敏原是酪蛋白(Casein，CN)、β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin，β-LG)和α-乳白蛋白(α-Lact?albumin，α-LA)。這些蛋白和人乳在蛋白質(zhì)類型、含量和同源性上面存在較大差異，含有可以被人體免疫系統(tǒng)識別的線性或構(gòu)象表位，當被攝入時，可能會被免疫系統(tǒng)識別為“有害”物質(zhì)，成為過敏原，經(jīng)過抗原呈遞細胞傳遞，刺激輔助性T 細胞（Th0）分化成少量Th1 和大量的Th2。Th1 細胞產(chǎn)生特征性細胞因子IL2 和干擾素（TNF），刺激激活的巨噬細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。Th2 細胞產(chǎn)生特征性細胞因子IL4 和IL5，IL5能夠刺激嗜酸粒細胞，IL4 刺激B 細胞激發(fā)成為效應(yīng)B細胞，產(chǎn)生大量的抗體，多數(shù)為免疫球蛋白E(Immu?noglobulin E，IgE)，少數(shù)為免疫球蛋白G（IgG）。經(jīng)過血液循環(huán)，IgG 附著到嗜酸粒細胞上，刺激其產(chǎn)生組胺。IgE 結(jié)合到腸道黏膜和氣管中的肥大細胞或血液中的嗜堿性細胞上面，當再接觸抗原物質(zhì)的時候，發(fā)生反應(yīng)，刺激肥大細胞產(chǎn)生組胺等化學物質(zhì)，引起一系列的過敏反應(yīng)，詳見圖1。研究顯示，牛乳過敏大多由IgE 介導(dǎo)，引發(fā)較為嚴重的過敏癥狀，出現(xiàn)皮膚、呼吸系統(tǒng)和胃腸道部分的疾病，具有速發(fā)性。少部分的輕到中度的牛乳過敏通常是非IgE 介導(dǎo)的，相關(guān)的臨床表現(xiàn)為乳蛋白誘導(dǎo)的輕度直腸出血或重度嘔吐，發(fā)病較為緩慢[19]。

圖1 牛乳過敏機制示意圖[20]

2 牛乳主要致敏蛋白

2.1 酪蛋白

酪蛋白約占乳蛋白的80%[21]，具有松散且高度水合的三級結(jié)構(gòu)，被分為αs1、αs2、β-和κ-CN4 種[18]。αs1、αs2 和β-CN 可與鈣等多價陽離子強烈結(jié)合，位于酪蛋白膠束的中心疏水區(qū)，κ-CN 含有少量的磷酸鹽基團，鈣結(jié)合能力弱，位于外周親水層[22]。正是由于這樣的結(jié)構(gòu)特點，酪蛋白容易被蛋白酶降解[18]。

目前對于4 種酪蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)有較為清楚的認識[6,23-25]，針對特定酪蛋白的致敏性也有許多的報道。Natale[26]的研究顯示，大約50%的乳蛋白過敏患者對αs1-CN 敏感，對αs2-CN 的敏感率為90%。已有許多的學者通過酶法切割、肽芯片免疫分析、肽定位等技術(shù)確定了這些蛋白的致敏片段[27-29]，甚至確定了一些IgE 結(jié)合的關(guān)鍵殘基[30]。Busse 等[31]在77%的牛乳致敏患者中檢測到了αs2-CN 上的6 個小的以及4個主要的 IgE 結(jié)合片段。Cerecedo 等[27]確定了 4 個αs2-CN 的致敏區(qū)域，其中有一個和Busse 的研究相同。Chatchatee等[25]發(fā)現(xiàn)了β-CN 上的6 個主要的和3個小的IgE 結(jié)合片段。詳見表2。但是，由于各項研究采用的方法不同，定位到的致敏片段有所差異，但是通過比較也不難發(fā)現(xiàn)，在這些致敏蛋白上的一些片段的致敏性是公認的，如αs1-CN 的氨基酸序列的第69-78 位 以 及 173-194 位 、αs2-CN 的 171-180 位 、β-CN 的 55-70 以 及 173-194 位 和κ-CN 的 第13-22、34-44位以及155-164位。

表2 主要牛乳致敏蛋白的抗體識別序列

2.2 乳清蛋白

乳清蛋白約占乳蛋白的20%，主要的致敏組分為α-LA 和β-LG[18]。乳清蛋白具有較高的二級、三級結(jié)構(gòu)，它們沒有被磷酸化，并且含有分子內(nèi)的二硫鍵，故結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定[22]，這種結(jié)構(gòu)對其致敏性起重要作用。根據(jù)不同的研究對象，牛乳過敏患者中α-LA 的特異性IgE 患病率在27.6%～62.8%之間[32-35]。β-LG 被認為是乳蛋白中最重要的過敏原，它在牛乳中含量較高，且在人乳中不存在，約有80%的牛乳過敏患者對β-LG過敏[23]。

Jarvinen 等[34]研究了11 位牛乳過敏患者血清對于α-LA 的識別，發(fā)現(xiàn)了 4 個 IgE 結(jié)合片段。Hochwarner等[35]研究α-LA 的致敏性，確定了α -LA 上的 6 個 IgE結(jié)合片段。Li 等人[36]確定了α-LA 上 6 個線性 IgE 結(jié)合片段，其中有兩個片段和Jarvinen 等人先前的研究結(jié)果一致。許多學者指出，β-LG 的121-134 位對于蛋白質(zhì)水解具有很高的抵抗力，是最具致敏潛力的片段[37-38]。Jarvinen 等[34]鑒定了β-LG 氨基酸序列上的 7個IgE 結(jié)合片段，但只有3 個被認為是免疫顯性的，其中一個片段為121-134 位，這對應(yīng)了前人的研究。Cerecedo 等[27]從過敏患者血清中鑒定出位于β-LG 肽段58-77 位的3 個片段，能夠被75%以上的受試者識別。Cong 等[30]確定了 4 個β-LG 的 IgE 結(jié)合片段和 2個 IgG 結(jié)合片段，且指出 20、23 和 27 位是 IgE 結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。

3 酶解乳蛋白的相關(guān)研究

蛋白酶可以水解蛋白質(zhì)肽鏈，破壞過敏蛋白的結(jié)構(gòu)，從而顯著降低蛋白質(zhì)的過敏性。對于牛乳蛋白來說，蛋白酶可以將其水解為小分子乳蛋白、乳蛋白肽甚至是氨基酸，能夠降低它的致敏性[20]。常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等。圖2 顯示了用胰蛋白酶水解β-LG 后剩余的5 個氨基酸序列（T6、T17、T18、T20 和T21）在未水解的β-LG 中的定位，乳過敏小鼠實驗表現(xiàn)為耐受，表示該酶能夠有效的把β-LG 上致敏的肽段切除。Prakash 等[40]用水解度5%的中性蛋白酶水解酪蛋白，通過間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測，發(fā)現(xiàn)在兔血清中，酪蛋白的致敏性降低了70%～80%，且驗證實驗顯示，血漿中的特異性IgE 含量和組胺水平都顯著降低。Babij 等[41]通過測定水解度、游離氨基酸強度以及色譜分析，研究一種絲氨酸蛋白酶水解乳清蛋白和酪蛋白對乳過敏患者的影響，發(fā)現(xiàn)這種酶可顯著降低蛋白質(zhì)的抗原性。

工業(yè)配方乳粉大多采用的是較為成熟的酶解技術(shù)，即熱加工輔助酶解法。但是，在應(yīng)用過程中，熱加工輔助酶解法也暴露出了一些諸如影響乳制品的營養(yǎng)和感官品質(zhì)等缺點[43]。隨著研究的深入，在低致敏性乳制品生產(chǎn)方面也探索了一些兼顧減敏功能、營養(yǎng)以及賞味性的新型的非熱加工輔助酶解技術(shù)。目前，基于對定向酶解機制的深入探索，也發(fā)表了一些成本更低，效果更優(yōu)的酶解前沿的技術(shù)。

圖2 原β-LG序列上耐受胰蛋白酶肽定位[42]

3.1 熱加工輔助酶解法

單一的熱處理工藝處理也會影響乳蛋白的抗體識別能力，但是酪蛋白對于熱處理非常穩(wěn)定，研究表明，120 ℃加熱15 min 對其致敏性無影響[44]，熱處理溫度過高對牛奶的營養(yǎng)影響較大。熱加工輔助酶解法通常采用巴氏殺菌，避免了單一的熱處理過高的溫度，在加熱過程中，乳蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，一些隱藏的致敏表位暴露，從而加強酶的作用效果。Iametti 等[45]用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在60 ℃，中性pH 條件下水解β-LG，通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，這兩種酶能夠有效的水解在加熱過程中短暫暴露的β-LG 的某些區(qū)域，經(jīng)過處理后，大多數(shù)致敏的表位位點消失。Kim 等[46]探究了胰蛋白酶和胃蛋白酶水解對于50 ℃熱處理前后的濃縮乳蛋白的水解物產(chǎn)率和致敏性的影響，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過熱處理后水解度更高，致敏性降低更顯著。韓仁嬌[47]探究了兩個中性蛋白酶復(fù)合水解β-LG 的最優(yōu)工藝條件，發(fā)現(xiàn)F 酶和G 酶同時分別添加0.44%和0.08%，酶解溫度55.2 ℃時，β-LG 水解率高達58.99%，明顯優(yōu)于市售同類產(chǎn)品。

熱加工輔助酶解法能夠有效降低牛乳的致敏性，復(fù)合酶的作用位點更多，其作用效果較單一酶更好，水解更充分[48]。但是也存在一定的缺點，可能產(chǎn)生對乳制品的營養(yǎng)和感官品質(zhì)產(chǎn)生不利的影響，另一方面，熱加工輔助酶解法破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，可能出現(xiàn)一些新的致敏表位[20]。

3.2 非熱加工輔助酶解法

酶解工藝經(jīng)非熱加工處理能夠更好的消除牛乳的致敏性，同時還兼顧牛乳的賞味性和營養(yǎng)性[49]。常用的非熱加工技術(shù)有超高壓、硫化、發(fā)酵等。這些技術(shù)能夠改變?nèi)榈鞍椎慕Y(jié)構(gòu)，和酶共同處理乳制品可以不可逆的去除乳蛋白的致敏原，從而使過敏表位不再被免疫系統(tǒng)所識別。Blayo 等[50]用超高壓均質(zhì)的方式處理乳清蛋白發(fā)現(xiàn)和未處理的樣品相比，乳清蛋白對胰蛋白酶攻擊的敏感性更強，蛋白的水解效率更高。Kananen 等[51]用硫化氫使蛋白構(gòu)象改變，后用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理，β-LG 的抗原性極大的降低。Cross[52]提出酶解之后再進行乳蛋白發(fā)酵處理，改性效果更好。

近年來，隨著一些新興的食品處理技術(shù)，如微波、超濾等技術(shù)的逐漸發(fā)展和趨于成熟，也逐漸應(yīng)用到了輔助酶解降低牛乳致敏中。Ei[11]研究了微波聯(lián)合胃蛋白酶水解牛乳蛋白對β-LG 致敏性的影響，結(jié)果顯示，65 ℃的時候，常規(guī)處理的β-LG 有37%的部分能夠抵抗胃蛋白酶的分解，但微波處理該蛋白，則完全水解。Quintieri 等[53]采用4 種酶結(jié)合超濾技術(shù)依次處理乳蛋白，處理后的電泳圖譜顯示β-LG 帶消失，證實酶結(jié)合超濾技術(shù)共同作用于濃縮乳蛋白具有良好的降低致敏性的效果。

非熱加工輔助酶解技術(shù)能夠很好地避免熱加工對牛乳造成的營養(yǎng)和感官特性的影響，作用效果優(yōu)良，但在應(yīng)用中，還應(yīng)該關(guān)注對牛乳品質(zhì)以及保藏方便的影響。

3.3 酶解前沿技術(shù)

酶水解能夠很好地降低乳制品的致敏性，且技術(shù)逐漸成熟，主打低致敏性的配方乳粉也逐漸增多，但是也存在選酶的盲目性，酶解產(chǎn)物具有隨機性，定向酶解機制不清楚等問題。而且，酶解后產(chǎn)生的一系列的生物活性肽對人類健康的促進作用也有待探索。目前在酶解降低乳蛋白致敏的較為前沿的研究主要集中在開發(fā)新型的肽酶、建立提高酶解效率的化學或生物體系、酶解產(chǎn)物進行鑒定以及靶向優(yōu)化上面。Oliveira 等[12]探究了4 種植物根莖或動物乳汁中的肽酶水解酪蛋白對其致敏性的影響，動物實驗表明，其中的兩種肽酶的水解物在牛乳過敏的小鼠中未出現(xiàn)過敏反應(yīng)。這些肽酶可以作為工業(yè)用酶，開發(fā)低致敏性配方乳粉。Shahriari 等[54]探討了不同水稻硫氧還蛋白（Thioredoxins，Trxs）還原β-LG 中的二硫鍵，對胰蛋白酶消化率和β-LG 致敏性的影響，發(fā)現(xiàn)能夠很好地提高胰蛋白酶的消化率并且降低了該蛋白的致敏性。尤其是兩種植物Trxs 比大腸桿菌和動物Trxs 成本更低。并建立了一個重組水稻谷胱甘肽/硫氧還蛋白系統(tǒng)，能夠特異性提高β-LG 的胰蛋白酶消化率。Nongonierma[55]提出用靶向酶解乳蛋白提高特定生物活性肽的釋放，開發(fā)能夠改善人類健康的水解物。

在應(yīng)用酶降低乳蛋白致敏性的研究中，探索高效且成本低的定向酶解技術(shù)，開發(fā)兼具減敏和益于人體健康的水解物成為研究的關(guān)鍵。

4 總 結(jié)

目前對于牛乳蛋白致敏的基礎(chǔ)性研究比較深入，致敏機制也逐漸清楚。應(yīng)用酶水解牛乳蛋白的研究較多，對于酶解液的功能性研究方面也逐漸加強[56-57]，但是實際應(yīng)用中也存在一些問題。綜上，關(guān)于應(yīng)用酶處理牛乳降低致敏性可以加強一下幾方面的研究：（1）整合已經(jīng)掌握的過敏原表位信息以及酶作用位點的情況，探索定向酶解的方式和機理。（2）篩選新型酶，以及對復(fù)合酶的應(yīng)用做更多研究，探索較優(yōu)的工藝。（3）進一步探究一些新技術(shù)如輻照、超聲波等輔助酶解技術(shù)的效果。（4）加強對酶解產(chǎn)物的分析和研究，開發(fā)具有新的功能的水解物，提高乳品的附加值。總之，目前應(yīng)用于酶解降低牛乳致敏性的研究還需要進行更加深入細致的探究，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)低致敏乳品的安全性，為我國的乳品工業(yè)的建設(shè)提供強大的助推力。