李玖玲，張子歸，郭 莉*

(華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院 1.腎內(nèi)風(fēng)濕免疫科；2.分子診斷湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430014)

全球癌統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2018年全世界腎癌(renal carcinoma)的新增40.3262萬(wàn)例、病死17.5098萬(wàn)例，分別占全球癌發(fā)病率的2.2%和病死率的1.8%[1]。由于腎癌對(duì)化療和放療有很強(qiáng)的抵抗力，治療后的長(zhǎng)期預(yù)后仍不理想。因此，了解腎癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)于尋找新的腎癌預(yù)后、治療和診斷生物標(biāo)志物具有重要意義。

MicroRNA(微小RNA，miRNA)是由18-25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，研究表明在腎癌中也證實(shí)了miRNA的異常表達(dá)水平影響腎癌的發(fā)生和發(fā)展[1]。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)miR-299-3p具有參與調(diào)控結(jié)腸癌、甲狀腺癌、卵巢癌、肺癌和肝癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和藥物敏感性等功能[5-8]，然而miR-299-3p在腎癌中對(duì)腫瘤增殖和遷移的分子機(jī)制還未有報(bào)道，因此選擇miR-299-3p作為研究的標(biāo)靶。并探討了miR-299-3p在腎癌細(xì)胞中的作用和分子機(jī)制，以期為尋找新的腎癌預(yù)后評(píng)估、臨床治療和診斷的生物標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人腎癌細(xì)胞系(786-O、769-P、ACHN和A498)和人正常腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2)(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))。

1.1.2 主要試劑：miR-299-3p mimic，NC-mimic(廣州銳博生物科技有限公司)；鼠抗人MAP3K12、E-cadherin、vimentin、N-cadherin、GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；Fast-Start Universal SYBR Green Master (Rox)試劑(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的處理及分組：調(diào)整腎癌786-O細(xì)胞密度為 1×105個(gè)/mL。然后將細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別設(shè)置miR-299-3p mimic組、NC-mimic組和空白對(duì)照組，其轉(zhuǎn)染方式參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 RNA提取、q-PCR檢測(cè)miR-299-3p和MAP3K12的表達(dá)量：收集轉(zhuǎn)染48 h后的786-O細(xì)胞，并采用Trizol試劑分別提取各組細(xì)胞中的總RNA。Fast-Start Universal SYBR Green Master (Rox)試劑對(duì)miR-299-3p和MAP3K12的相對(duì)表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，分別以U6和GAPDH作為miRNA和mRNA的內(nèi)參。引物序列：GAPDH上游引物:5′-ATGTTCGT CATGGGTGTGAA-3′，下游引物:5′-CAGTGATGGC ATGGACTGT-3′；U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCA GCACA-3′，下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTG CGT-3′；miR-299-3p上游引物:5′-TTCAGTGTAAAC ATCCTCGACTG-3′,下游引物:5′-TGGCAATGTCGTG GAGTCG-3′；MAP3K12上游引物:5′-GTGTGGG AAGCAACAGTCTC3′,下游引物:5′-TACTTCTTCC CGCCACTCTG-3′。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)熒光素酶活性：培養(yǎng)786-O細(xì)胞至50% ～ 70%匯合時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)將質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)入細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為4組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔:1)NC-mimic+MAP3K12 WT；2)miR-299-3p mimic+MAP3K12 WT；3)NC-mimic+MAP3K12 MT；4)miR-299-3p mimic+MAP3K12 MT。培養(yǎng)48 h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行各組熒光素酶活性測(cè)量。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種于Corning 96孔板中，每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞，分別于培養(yǎng)24、48和72 h的前4 h每孔加入 20 μL MTT孵育培養(yǎng)，每孔加入150 μL DMSO，振蕩8～10 min后，酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度值(A)。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲：將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種于Corning 6孔板中，每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞，分別于0和48 h固定顯微鏡下拍照。同時(shí)將單細(xì)胞培養(yǎng)懸液，接種于Transwell小室中，每個(gè)小室接種1×105個(gè)細(xì)胞，48 h后固定后置于顯微鏡下拍照，并記錄穿過(guò)Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 體外成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤大?。河? ～ 8周的BALB/C裸鼠進(jìn)行體外腫瘤異種移植實(shí)驗(yàn)。將1×106個(gè)786-O細(xì)胞皮下注射到BALB/C裸鼠的上背部。每周測(cè)量腫瘤大小，腫瘤體積計(jì)算公式為：W2×L/2。

1.2.7 Western blot檢測(cè)MAP3K12、E-cadherin、vimentin、N-cadherin蛋白的表達(dá)：提取總蛋白后，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)濃度，選擇的一級(jí)抗體：抗MAP3K12抗體(1∶1 000)、E-cadherin 抗體(1∶1 000)、vimentin抗體(1∶1 000)、N-cadherin抗體(1∶1 000)、抗GAPDH抗體(1∶2 000)，然后用二級(jí)抗體(1∶5 000)孵育。用Bio-Rad成像分析系統(tǒng)測(cè)量每個(gè)蛋白質(zhì)樣品。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-299-3p在腎癌細(xì)胞系中低表達(dá)

miR-299-3p在腎癌細(xì)胞系中表達(dá)降低，且miR-299-3p在786-O細(xì)胞中的表達(dá)水平最低(P<0.05)(圖1)。因此，進(jìn)一步選擇了786-O細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

*P<0.05 compared with control group(HK-2)圖1 miR-299-3p在腎癌細(xì)胞系和正常腎上皮細(xì)胞系中的表達(dá)Fig 1 RT-qPCR analysis of expression levels of miR-299-3p in four cell lines(786-O,769-P, ACHN and A498) and one normal cell line

2.2 miR-299-3p在腎癌細(xì)胞中直接靶向調(diào)控MAP3K12的表達(dá)

在線(xiàn)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了miR-299-3p的共同靶基因?yàn)镸AP3K12(圖2A)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示miR-299-3p mimic能顯著降低野生型MAP3K12熒光素酶的活性(P<0.05)(圖2B)。與陰性對(duì)照組相比，miR-299-3p mimic組的MAP3K12表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖2C)。和NC-mimic組和空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)入miR-299-3p mimic后，miR-299-3p表達(dá)顯著上升(P<0.05)(圖2D)，而NC-mimic組和空白對(duì)照組的miR-299-3p表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 miR-299-3p下調(diào)MAP3K12表達(dá)，調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)路徑影響腎癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

過(guò)表達(dá)miR-299-3p可顯著抑制786-O細(xì)胞增殖能力，而miR-299-3p mimic+MAP3K12共轉(zhuǎn)染則減弱過(guò)表達(dá)miR-299-3p抑制786-O細(xì)胞增殖能力(P<0.05)(圖3A)。過(guò)表達(dá)miR-299-3p可顯著抑制786-O細(xì)胞遷移、侵襲能力，而miR-299-3p mimic+MAP3K12共轉(zhuǎn)染減弱了由miR-299-3p mimic誘導(dǎo)抑制786-O細(xì)胞的遷移和侵襲的能力(P<0.05)(圖3B～D)。與對(duì)照組相比，miR-299-3p mimic組的腫瘤體積也顯著縮少(P<0.05)(圖3E)。此外，上調(diào)miR-299-3p可導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)，N-cadherin、vimentin、MAP3K12蛋白水平顯著降低；然而，miR-299-3p mimic+MAP3K12共轉(zhuǎn)染阻止了E-cadherin蛋白的上調(diào)，以及下調(diào)N-cadherin、vimentin、MAP3K12蛋白(P<0.05)(圖3F,G)。

A.online bioinformatics database predicts that the common target gene of miRNA-299-3p was MAP3K12;B.luciferase reporter assay for the luciferase activity of NC-mimic+ MAP3K12 WT,miR-299-3p mimic+MAP3K12 WT,NC-mimic+MAP3K12 MT,miR-299-3p mimic+MAP3K12 MT in 786-O cells;C.expression levels of MAP3K12 in 786-O cells transfected with miR-299-3p mimic,NC-mimic;D.expression levels of miRNA-299-3p in 786-O cells transfected with miR-299-3p mimic,NC-mimic,negative control;*P<0.05 compared with control group圖2 miR-299-3p在腎癌細(xì)胞786-O中直接靶向調(diào)控MAP3K12的表達(dá)Fig 2 miR-299-3p directly targeted MAP3K12 expression in 786-O n=3)

3 討論

新近的研究表明，在不同類(lèi)型的腫瘤中miRNA具有獨(dú)特的表達(dá)譜，在多種癌發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用[9-10]，促進(jìn)了miRNA作為腫瘤標(biāo)志物的預(yù)防、診斷、治療策略的不斷深入研究[11-12]。已報(bào)道m(xù)iR-299-3p在惡性間皮瘤細(xì)胞中有不同的表達(dá)并調(diào)節(jié)乳腺癌和纖維肉瘤細(xì)胞的侵襲性，但是miR-299-3p在腎癌中作用和功能研究尚未見(jiàn)報(bào)告。本研究探討了miR-299-3p 腎癌細(xì)胞中的作用和分子機(jī)制。RT-qPCR和細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-299-3p的表達(dá)變化可能同腎癌的發(fā)生以及腫瘤的進(jìn)展具有相關(guān)性。

運(yùn)用多個(gè)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了miR-299-3p的共同靶基因?yàn)镸AP3K12，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果。MAP3K12屬于混合譜系激酶(mixed lineage kinase，MLK)的一類(lèi)，其特征是與絲氨酸/蘇氨酸激酶以及其一級(jí)結(jié)構(gòu)中的酪氨酸激酶同源，并具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的功能[13]。已有研究證實(shí)芳基烴受體通過(guò)促進(jìn)miR-150-5p調(diào)節(jié)MAP3K12的表達(dá)以抑制前列腺癌的增殖和遷移[14]。本研究證實(shí):miR-299-3p通過(guò)靶向調(diào)節(jié)MAP3K12的表達(dá)抑制腎癌786-O細(xì)胞系增殖、遷移、侵襲能力。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤的遷移和侵襲過(guò)程中具有重要作用，在這一過(guò)程中上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)異常，如E-cadherin 蛋白的上調(diào)和N-cadherin、vimentin蛋白的下調(diào)。Western blot結(jié)果證實(shí):miR-299-3p能調(diào)控腎癌細(xì)胞EMT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。綜上所述，miR-299-3p靶向下調(diào)MAP3K-12表達(dá)并通過(guò)調(diào)控EMT途徑影響腎癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。表明miR-299-3p具有作為腎癌預(yù)防、早期診斷、臨床治療、預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物的潛力。

A.MTT assay showed that miR-299-3p mimic+MAP3K12,miR-299-3p mimic,NC-mimic plasmid regulates the proliferation ability in 786-O cells;B,D.wound healing assay showed that miR-299-3p mimic+MAP3K12,miR-299-3p mimic,NC-mimic regulates 786-O cells’ migration;C.Transwell assays showed that miR-299-3p mimic+MAP3K12,miR-299-3p mimic,NC-mimic regulates 786-O cells’ invasive;E.BALB/c nude mice injected with 786-O cells transfected with miR-299-3p mimic,NC-mimic plasmid subcutaneously and analysis of tumor volume of mice measured every week;F,G.Western blot analysis the expression levels of E-cadherin,N-cadherin,vimentin,and MAP3K12 in 786-O cells transfected with miR-299-3p mimic,NC-mimic,miR-299-3p mimic+MAP3K12;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with miR-299-3p mimic group圖3 miR-299-3p靶向下調(diào)MAP3K12表達(dá)，調(diào)控EMT路徑，影響腎癌細(xì)胞786-O功能Fig 3 miR-299-3p down-regulated MAP3K12 expression，regulated EMT pathway and affected 786-O