于 銳，張新茹，王丹丹，何 平，白 瑜，田 密，張蓓茹*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 腎內(nèi)科,遼寧 沈陽 110004；2.沈陽市蘇家屯區(qū)中心醫(yī)院 腎內(nèi)科,遼寧 沈陽 110101)

近年來隨著放射診斷技術(shù)的進(jìn)展與介入治療的廣泛應(yīng)用，碘對比劑(iodine contrast)使用明顯增加，盡管碘對比劑本身已不斷的改良，但對比劑腎病(contrast-induced nephropathy，CIN)仍頻頻發(fā)生。研究表明腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)不僅可以作為急慢性腎損傷的早期生物學(xué)標(biāo)志物，而且也參與了腎臟病的損傷與修復(fù)過程[1]。本研究團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)，對比劑腎病大鼠模型尿KIM-1水平在早期即明顯增加，可作為對比劑腎病早期的生物學(xué)標(biāo)志物[2]，但KIM-1是否在對比劑腎病的發(fā)展中具有病理作用尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞系HK-2，初步探索KIM-1是否參與對比劑腎病HK2細(xì)胞凋亡及其可能途徑，明確KIM-1在碘對比劑所致HK2細(xì)胞損傷中可能的病理作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

人腎小管上皮細(xì)胞系HK-2以及KIM-1-siRNA、MCP-1引物(中國廣州吉妮歐公司)；DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、PBS磷酸鹽緩沖液和Opti-MEM(Hycloe公司)；胰蛋白酶(Gbico公司)；DEMSO和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(Sigma-Aldrich公司)；青霉素-鏈霉素溶液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、細(xì)胞膜蛋白與胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和ROS檢測試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)公司)；LipofecamineTM2000(Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR相關(guān)試劑(TaKaRa公司)；碘海醇(iohexol)(通用電氣藥業(yè)上海有限公司)；KIM-1抗體(Abcam公司)；GAPDH抗體(Proteintech Group公司)；SOD和MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；Bax和Bcl-2抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:以含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-鏈霉素溶液的DMEM/F12培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，取3～5代對數(shù)增殖期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)以5×105個(gè)細(xì)胞/孔將細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞至70%～80%匯合時(shí)，更換無血清培養(yǎng)液同步化，依照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 細(xì)胞的分組:用10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將35 g/100 mL的碘海醇稀釋成與體內(nèi)使用對比劑后腎小管腔內(nèi)濃度一致的75 mg/mL工作液，處理HK-2細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)(0、0.5、2、4和12 h)[3]，觀察不同時(shí)間點(diǎn)KIM-1的表達(dá)情況，以確定本實(shí)驗(yàn)的最佳干預(yù)時(shí)間點(diǎn)。在觀察KIM-1在對比劑所致HK-2細(xì)胞損傷中的病理作用實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞分為對照組(A)，對比劑組(B)，對比劑+空載組(C)和對比劑+KIM-1-siRNA組(D)，75 mg/mL的碘海醇均在細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后24 h加入，加入后2 h收集細(xì)胞,并進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Western blot檢測KIM-1蛋白:收集不同組細(xì)胞，按照提取試劑盒說明書提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液并煮沸，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)膜和5% BSA封閉1 h，按照抗體說明書推薦比例對一抗進(jìn)行稀釋，在4 ℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后加入ECL發(fā)光液顯影，Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度值分析。

1.2.4 Annexin V-FITC檢測細(xì)胞凋亡：收集不同組細(xì)胞1 000×g離心5 min，棄上清，用PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取5×104個(gè)重懸的細(xì)胞，再次1 000×g離心5 min，棄上清，加入195 μL annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育10 min。1 000×g離心5 min，棄上清，加入190 μL annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，混勻冰浴放置，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 MDA、SOD和ROS含量的測定：測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)時(shí)，收集不同組細(xì)胞上清液，分別采用硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法，按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行操作。而測定活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量時(shí)，收集不同組細(xì)胞，采用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)利用熒光探針DCFH-DA按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行ROS測定。

1.2.6 RT-qPCR檢測MCP-1：收集不同組細(xì)胞,按照總RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA的濃度。取500 ng RNA按照cDNA合成試劑盒說明書步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA。隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)如下：MCP-1上游引物：5′-GCAGAAGTGGGTTCAGGATT-3′，下游引物：5′-CAAGTCTTCGGAGTTTGGGT-3′。擴(kuò)增完成后通過2-△△Ct法計(jì)算MCP-1的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 碘海醇導(dǎo)致HK-2細(xì)胞KIM-1表達(dá)增加

給予75 mg/mL碘海醇處理HK-2細(xì)胞不同時(shí)間，在2 h時(shí)KIM-1蛋白表達(dá)量最多，在4和12 h時(shí)KIM-1表達(dá)有所下降(圖1)。根據(jù)該結(jié)果確定碘海醇處理HK-2細(xì)胞2 h作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)間。

2.2 靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染使碘海醇所致HK-2細(xì)胞KIM-1表達(dá)減少

給予75 mg/mL碘海醇處理HK-2細(xì)胞2 h，KIM-1蛋白表達(dá)明顯增多，但靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染后能夠有效抑制KIM-1的表達(dá)(圖2)。

*P<0.05 compared with other group圖1 75 mg/mL碘海醇處理HK-2細(xì)胞不同時(shí)間KIM-1蛋白表達(dá)情況Fig 1 Expression of KIM-1 protein in HK-2 cells treated with iohexol at different

A.control;B.iohexol;C.iohexol+vehicle;D.iohexol+KIM-1-siRNA;*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with C group圖2 75 mg/mL碘海醇處理HK-2細(xì)胞2 h時(shí)各組細(xì)胞KIM-1蛋白表達(dá)情況Fig 2 Expression of KIM-1 protein in HK-2 cells treated with iohexol for 2 hours

2.3 靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染能夠減輕碘海醇所致HK-2細(xì)胞的凋亡

HK-2細(xì)胞給予碘海醇處理2 h后，HK-2細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，而給予靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染后，HK-2細(xì)胞凋亡程度明顯減輕(P<0.05)(圖3)。碘海醇使Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低，而靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染后，相比較空載組Bax表達(dá)下降，而Bcl-2蛋白表達(dá)上升(P<0.05)(圖4)。

2.4 KIM-1可能通過促進(jìn)氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)參與碘海醇所致HK-2細(xì)胞凋亡

碘海醇處理HK-2細(xì)胞2 h后(圖5)，與對照組比較，MDA、ROS水平明顯上升，而SOD水平下降，同時(shí)MCP-1表達(dá)增加(P<0.05)。而給予靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染后，上述改變均得到部分糾正，在碘海醇處理下，siRNA組較空載組HK-2細(xì)胞MDA、ROS水平有所下降，SOD水平上升，同時(shí)MCP-1表達(dá)下降(P<0.05)。

A.control;B.iohexol;C.iohexol+vehicle;D.iohexol+KIM-1-siRNA;*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with C group圖3 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)評估HK-2細(xì)胞凋亡程度Fig 3 Assessment of apoptotic degree of HK-2 cells by flow

A.control;B.iohexol;C.iohexol+vehicle;D.iohexol+KIM-1-siRNA;*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with C group圖4 Western blot方法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)評估HK-2細(xì)胞凋亡程度Fig 4 Expression of Bax and Bcl-2 protein was detected by Western blot to evaluate the apoptotic degree of HK-2 n=3)

A.control;B.iohexol;C.iohexol+vehicle;D.iohexol+KIM-1-siRNA;*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with C group圖5 MDA、ROS和SOD評估HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激，MCP-1評估HK-2細(xì)胞炎性反應(yīng)Fig 5 MDA,ROS and SOD assessed oxidative stress in HK-2 cells,and MCP-1 assessed inflammatory response in HK-2 n=3)

3 討論

KIM-1是新近發(fā)現(xiàn)的在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)的一種 Ⅰ 型跨膜蛋白。目前可以通過檢測尿液中KIM-1的水平來反映腎小管損傷程度，在臨床中也將KIM-1作為各種原因引起的急性腎小管損傷的早期敏感生物標(biāo)志物[4-5]。對比劑腎病是臨床中常見的急性腎損傷的病因，目前仍然以肌酐水平的升高來診斷，筆者團(tuán)隊(duì)在動(dòng)物模型中證實(shí)KIM-1是反映對比劑腎病(CIN)早期生物標(biāo)志物[3]。在臨床中也得到同樣的結(jié)論[6]。

KIM-1在腎臟的生理功能以及病理作用仍不明確，但是越來越多的證據(jù)支持KIM-1的早期表達(dá)不僅僅是反映腎小管急性損傷的生物標(biāo)志物，而是參與了腎臟疾病的進(jìn)展[7-8]。在一項(xiàng)納入4 739例患者，平均隨訪16.6年的研究中發(fā)現(xiàn)基線血清KIM-1水平與eGFR下降速率呈明顯正相關(guān)，而且伴隨著基線KIM-1水平的增加，在隨訪期間因腎功能衰竭住院風(fēng)險(xiǎn)也明顯增加[9]。研究發(fā)現(xiàn)雙側(cè)缺血/再灌注急性腎損傷大鼠模型尿KIM-1水平與進(jìn)展至慢性期腎小管間質(zhì)纖維化的程度呈密切相關(guān)性[10]。建立持續(xù)在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)KIM-1的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)即使在沒有外界任何促進(jìn)腎小管間質(zhì)損傷的因素存在下，4周后轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)出現(xiàn)腎臟炎性反應(yīng)和腎小管間質(zhì)纖維化，且進(jìn)行性加重[11]。本研究中也進(jìn)一步證實(shí)在碘海醇刺激下KIM-1表達(dá)增加不僅僅是細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志物，而且參與了細(xì)胞凋亡的過程，具有重要的病理作用。

KIM-1通過何種途徑參與腎臟病機(jī)制尚不十分明確，促進(jìn)腎臟局部炎性反應(yīng)被認(rèn)為是重要的機(jī)制之一[11]。近些年研究提示炎性反應(yīng)過程也參與了對比劑所致的腎損傷過程[12]。在本研究中主要通過評估KIM-1表達(dá)的抑制對碘海醇所致HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響進(jìn)一步探討KIM-1參與對比劑腎病發(fā)病的可能機(jī)制，結(jié)果證實(shí)KIM-1可能部分通過促進(jìn)炎性反應(yīng)進(jìn)而參與對比劑所致腎臟損傷過程。

綜上所述，本研究初步探討了在對比劑所致腎小管上皮細(xì)胞損傷過程中KIM-1的病理作用，研究結(jié)果提示KIM-1在對比劑干預(yù)下的高表達(dá)可能通過促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)而參與細(xì)胞損傷過程。這一研究結(jié)果更進(jìn)一步證實(shí)了KIM-1不僅僅是對比劑腎病(CIN)的早期生物標(biāo)志物，而且參與到病理過程中，對KIM-1進(jìn)行干預(yù)可能成為臨床預(yù)防或治療對比劑腎病的有效手段，為將來有效防治對比劑腎病(CIN)提供理論基礎(chǔ)。