周 菁，李索妮

(陜西省腫瘤醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，陜西 西安 710061)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer)作為常見的消化道惡性腫瘤之一，近幾年發(fā)病率逐漸增高。僅2014年中國結(jié)直腸癌新發(fā)病例就有79 180例，病死率高達(dá)13.27/10萬[1]。其中癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是致死的主要原因[2]。因此，探索結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制有望為其治療提供有效的靶點(diǎn)。

分泌型卷曲相關(guān)蛋白2 (secreted frizzled-related protein 2，SFRP2)作為SFRP家族成員之一，三維結(jié)構(gòu)中存在一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，與Wnt配體高度同源，因此可以作為拮抗劑抑制Wnt/β-catenin信號通路[3]。SFRP2在一些惡性腫瘤中的表達(dá)失調(diào)已被報道，但是它在這些癌中的作用機(jī)制不盡相同。比如，在骨肉瘤[4]、腎癌[5]和乳腺癌[6]中呈現(xiàn)高表達(dá)具有促癌作用；然而，在胃癌[7]、結(jié)直腸癌[8]、口腔鱗癌[9]中，SFRP2高甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，被認(rèn)為具有抑癌作用。目前大多數(shù)學(xué)者只關(guān)注于SFRP2甲基化在結(jié)直腸癌檢測中的應(yīng)用，其抑癌的具體分子機(jī)制尚不清楚。本文通過檢測SFRP2在結(jié)直腸癌細(xì)胞的表達(dá)，分析其對結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480增殖、遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系(human normal colonic epithelial cell line)HCoEpiC、結(jié)直腸癌細(xì)胞系(human colorectal cancer cell line)SW480和人胚胎腎上皮細(xì)胞系HEK293T(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)；RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素(Thermo Fisher Scientificals公司)；慢病毒包裝試劑盒(Origene公司)；CCK-8、BCA試劑盒(北京碧云天生物公司)；SFRP2、低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、Twist抗體(Abcam公司)；IDF-11774(Selleck公司)；FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；超低溫高速離心機(jī)[SIGMA(3K15型)]。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)：將HCoEpiC和SW480培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1%青霉素、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件：37 ℃，5% CO2。每隔2 d更換新鮮培養(yǎng)基。HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上。

1.2.2 RT-qPCR檢測mRNA水平：取處于對數(shù)增殖期細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒提取RNA，Nanodrop測量260/280處吸光度值。取1 μg RNA作為模板，采用FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒檢測mRNA水平，以GAPDH作為內(nèi)參。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個復(fù)孔。mRNA表達(dá)量比較采用2-△△Ct計算，其中Ct=△Ct目的-△Ct內(nèi)參，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對照組。引物由上海生工合成。SFRP2上游引物：5′-GGAGACCAAGAGCAAGACCAT-3′，下游引物：5′-GCACTGCAAGCTGTCTTTGA-3′；β-catenin上游引物：5′-TACTGTCCTTCGGGCTGGTG-3′，下游引物：5′-CGGGTATCCTGATGTTGCGC-3′；Snail上游引物：5′-GGCTCCTTCGTCCTTCTCCTCTAC-3′，下游引物：5′-CCAGGCTGAGGTATTCCTTGTTGC-3′；HIF-1α上游引物：5′-TGCACAGGCCACATTCACGTA-3′，下游引物：5′-GTTCACAAATCAGCACCAAGCA-3′；Twist上游引物：5′-CGGCCAGGTACATCGACT-3′，下游引物：5′-CCATCCTCCAGACGGAGA-3′；GAPDH上游引物：5′-CTGACTTCAACAGCGACACC-3′，下游引物：5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3′。

1.2.3 Western blot檢測蛋白水平：取處于對數(shù)增殖期的細(xì)胞，加入含有1 μmol/L PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min,離心30 min，收集上清。采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度，取50 μg蛋白上樣于分離膠為12%的SDS-PAGE上，160 V恒壓1 h。濕轉(zhuǎn)法恒流250 mA轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1h；加入一抗[SFRP2(1∶1 000)；β-catenin(1∶1 000)；Snail(1∶1 000)；HIF-1α(1∶1 000)；Twist(1∶5 000)]。4 ℃孵育過夜，PBST洗滌，二抗室溫孵育1 h。曝光顯影。

1.2.4 構(gòu)建敲減SERP2穩(wěn)轉(zhuǎn)SW480細(xì)胞株及分組：首先將HEK293T細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，孵育過夜后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，步驟按照說明書操作。48 h后，采用0.45 μm的濾膜過濾收集含有慢病毒的細(xì)胞上清。同時，將SW480接種至6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%，加入收集到的含有慢病毒的細(xì)胞上清，4 d后，采用Western blot和RT-qPCR 檢測SERP2的敲減效率。實(shí)驗(yàn)分組如下：1)shNC組，轉(zhuǎn)染control shRNA;2)shSERP2組，轉(zhuǎn)染SERP2 shRNA;3)shSERP2+ IDF-11774組，轉(zhuǎn)染SERP2 shRNA的細(xì)胞，同時采用20 μmol/L IDF-11774處理。

1.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力：將2×103個細(xì)胞接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)12、24和48 h后，向每孔內(nèi)加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h后，檢測酶標(biāo)儀450 nm處的吸光度值。

1.2.6 Transell小室法實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力：遷移：分別收集細(xì)胞，無血清培養(yǎng)液重懸，取5×104細(xì)胞接種于Transwell小室上層，下層加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，用棉簽將上層小室內(nèi)中的細(xì)胞擦去，結(jié)晶紫染色30 min。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移數(shù)。侵襲：預(yù)先在Transwell小室上層鋪一層Matrigel 基質(zhì)膜，其他同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SFRP2在結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480及結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

SW480細(xì)胞中SFRP2的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著低于HCoEpiC細(xì)胞(P<0.01)(圖1A,B)。另外，生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫GEPIA顯示(圖1C)癌組織中SERP2的表達(dá)水平低于癌旁組織(P<0.05)。

2.2 敲降SERP2后SW480細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力增強(qiáng)

與shNC組比較，shSFRP2組細(xì)胞中SFRP2的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)(圖2A,B)；而增殖、遷移和侵襲能力顯著提高(P<0.001)(圖2C～E)。

*P<0.05 compared with normal samples；**P<0.001 compared with HCoEpiC group圖1 SFRP2在結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480(A和B) 及結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)(C)Fig 1 Expression of SFRP2 in colorectal cancer cell line SW480 (A and B) and colorectal cancer

A.Western blot;B.RT-qPCR;C.CCK-8;D,E.Transwell;*P<0.001 compared with shNC group圖2 SERP2對SW480細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響Fig 2 Effect of SERP2 on proliferation,migration and invasion of SW480 n=3)

2.3 HIF-1α和Twist在SW480細(xì)胞中的表達(dá)

與shNC組比較，shSFRP2組HIF-1α和Twist表達(dá)水平明顯提高(P<0.01)(圖3)。

2.4 HIF-1α抑制劑(IDF-11774)降低SERP2敲降對SW480細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響

與shSFRP2組比較，shSFRP2+IDF-11774組細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力顯著降低(P<0.001) (圖4)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)54.39%的結(jié)直腸癌患者血漿樣本中SFRP2存在高度甲基化[10]。因此，目前認(rèn)為SFRP2是結(jié)直腸癌的抑癌基因。但是其與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制尚未清楚。

本研究首先確定了SFRP2在結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480中表達(dá)量低于正常上皮細(xì)胞。初步表明SFRP2在結(jié)直腸癌中可能是抑癌基因。SFRP2在Wnt通路中起關(guān)鍵作用，在絨(毛)膜癌[11]、骨肉瘤[4]、乳腺癌[6]中SFRP2能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，具有促癌作用。然而在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)TET1可以通過激活SFRP2表達(dá)抑制癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提示SFRP2具有抑癌作用[12]。本文敲降SFRP2后，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力顯著提高，表明了SFRP2在結(jié)直腸癌中為抑癌基因。

β-catenin、Snail、Twist是與EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，過表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落，向周邊組織轉(zhuǎn)移[13]。本研究發(fā)現(xiàn)敲降SFRP2后，Twist表達(dá)水平顯著提高，而β-catenin、Snail的表達(dá)水平并未受到影響。所以推測SFRP2通過調(diào)控Twist的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。目前已證實(shí)HIF-1α可以通過激活Twist的表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖侵襲[14]。另外研究還發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達(dá)受Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控[15]，而SFRP2是Wnt配體的拮抗劑，因此推斷SFRP2可能通過阻斷Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)來抑制HIF-1α表達(dá)，從而限制結(jié)直腸癌的進(jìn)展。基于該推測，本文檢測了HIF-1α在結(jié)直腸癌的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲降SFRP2后，SW480細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)水平顯著升高。證實(shí)了在結(jié)直腸癌中SFRP2作為Wnt配體的拮抗劑首先抑制了HIF-1α表達(dá)，然后阻滯Twist激活，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化受阻，最終控制了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。緊接著，本文采用HIF-1α抑制劑(IDF-11774)刺激shSFRP2 SW480細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IDF-11774可以降低SERP2敲降對SW480細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。進(jìn)一步說明了SFRP2通過調(diào)控HIF-1α-Twist信號通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲。

*P<0.001 compared with shNC group圖3 HIF-1α和Twist在SW480細(xì)胞中的表達(dá)Fig 3 Expression of HIF-1α and Twist in SW480 cells n=3)

*P<0.001 compared with shSFRP2 group圖4 IDF-11774對SW480細(xì)胞增殖(A)、遷移和侵襲能力(B和C)的影響Fig 4 Effect of IDF-11774 on proliferation (A),migration and invasion (B and C) of SW480 cells n=3)

綜上所述，SFRP2可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，可能是參與結(jié)直腸癌發(fā)生的負(fù)調(diào)控因子。后續(xù)可以嘗試設(shè)計開發(fā)SFRP2激活劑用于結(jié)直腸癌治療。