葛永春，吳旭干

( 1.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)部淡水種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306； 2.上海登瀛水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，上海 202164； 3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)動物遺傳育種上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306； 4.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306 )

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)是我國最重要的養(yǎng)殖蟹類，2017年全國成蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量為7.509×105t[1]，產(chǎn)值500多億元。性腺作為中華絨螯蟹的主要可食部位之一，其發(fā)育的優(yōu)劣直接關(guān)系到中華絨螯蟹的食用價值和經(jīng)濟價值[2-3]。由于雌蟹的性腺指數(shù)遠高于雄蟹，且雌蟹性腺(卵巢)中富含n-3高度不飽和脂肪酸、必需氨基酸和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，因此卵巢發(fā)育良好的雌蟹(紅膏蟹)市場價格較高[2-4]。此外，我國中華絨螯蟹養(yǎng)殖苗種主要依靠挑選池塘養(yǎng)殖親本進行人工繁殖，所以中華絨螯蟹的卵巢發(fā)育情況直接關(guān)系到后續(xù)的交配繁殖[4-5]。

生殖蛻殼是短尾派蟹類自亞成體向成體過渡的一次關(guān)鍵蛻殼，中華絨螯蟹卵巢通常在生殖蛻殼后快速發(fā)育[3,6-7]。但是，蟹類蛻殼期間及剛蛻殼后非常脆弱，極易遭受敵害生物和同類的侵襲而死亡[8]。此外，池塘養(yǎng)殖過程中通常在中華絨螯蟹卵巢發(fā)育的后期投喂優(yōu)質(zhì)餌料進行育肥，以促進卵巢發(fā)育和提高營養(yǎng)價值[2,9]。因此查明中華絨螯蟹生殖蛻殼后的成活率和卵巢發(fā)育規(guī)律不僅對其在實際生產(chǎn)中的養(yǎng)殖管理有一定的現(xiàn)實意義，而且可以為學(xué)者們在科研工作中選擇不同卵巢發(fā)育階段的中華絨螯蟹雌體提供一定的基礎(chǔ)資料。鑒于此，筆者以生殖蛻殼前雌蟹為對象，研究其在群體養(yǎng)殖條件下生殖蛻殼后的成活率、質(zhì)量增加率和卵巢發(fā)育規(guī)律的變化，以進一步為中華絨螯蟹養(yǎng)殖管理、育肥和捕撈上市等提供基礎(chǔ)資料和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗蟹及試驗設(shè)計

試驗蟹于2018年8月初取自上海崇明東風(fēng)試驗基地的室外養(yǎng)殖池塘。試驗初期選取肢體健全、活力好且均處于生殖蛻殼前的雌蟹80只，體質(zhì)量為50～70 g，放入室內(nèi)2.5 m×3.75 m×1.0 m聚乙烯水桶中，暫養(yǎng)一周后開始正式試驗。

試驗共設(shè)計3個水桶，每個水桶內(nèi)隨機放入15只中華絨螯蟹，3個水桶隨機標(biāo)記為1#、2#、3#，并對每個桶內(nèi)的中華絨螯蟹進行稱量質(zhì)量和標(biāo)記，用油漆筆在蟹殼上標(biāo)記為1#-1～1#-15，以此類推，以便于后續(xù)的觀察。試驗過程中，每日檢查和記錄死亡個體的數(shù)量、完成生殖蛻殼個體的數(shù)量和蛻殼時間。當(dāng)發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹生殖蛻殼后的殼硬化后，取出稱量質(zhì)量并記錄。為研究中華絨螯蟹生殖蛻殼后的卵巢發(fā)育規(guī)律，取生殖蛻殼后的30只雌體繼續(xù)養(yǎng)殖60 d，每5～10 d解剖1次。具體的采樣時間為6次：雌蟹生殖蛻殼后1～10 d、11～20 d、21～30 d、31～40 d、41～50 d、51～60 d。每個采樣時間均隨機解剖3只，記錄其卵巢質(zhì)量和體質(zhì)量，同時取少量卵巢組織固定于波恩氏液中，以研究其生殖蛻殼后的卵巢發(fā)育情況。試驗期間，每個養(yǎng)殖水桶中均放有聚氯乙烯板和水草等遮蔽物供蟹隱藏。

1.2 養(yǎng)殖管理

試驗期間，每日18:00投喂配合飼料，投喂量為蟹體質(zhì)量的1%～3%，次日8:00清除殘餌和糞便，并根據(jù)殘餌、水溫和攝食情況適當(dāng)調(diào)整投餌量。每隔8 h觀察并記錄中華絨螯蟹蛻殼和死亡情況，以便于統(tǒng)計蛻殼時間和成活率。一旦發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹蛻殼，立即將其放入單養(yǎng)塑料盒中，待蟹殼硬化后再用記號筆標(biāo)注放入原先的養(yǎng)殖水槽中繼續(xù)養(yǎng)殖。采用循環(huán)水工藝對養(yǎng)殖用水進行凈化處理，定期采用曝氣后的自來水來補充蒸發(fā)掉的水分。試驗期間，24 h連續(xù)充氧，自然光照，試驗期間自然水溫19.2～28.5 ℃。養(yǎng)殖水體pH 7.0～8.5，溶解氧>4 mg/L，氨氮<0.5 mg/L，亞硝態(tài)氮<0.15 mg/L。

1.3 數(shù)據(jù)采集

1.3.1 質(zhì)量增加率和死亡率

試驗過程中，每日檢查和記錄完成生殖蛻殼和死亡個體的數(shù)量，當(dāng)發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹生殖蛻殼后的殼硬化后取出稱量質(zhì)量，稱量前用干毛巾拭去體表水分，電子天平稱量(精確至0.01 g)，測量完成后放回原處繼續(xù)養(yǎng)殖。根據(jù)下式計算生殖蛻殼后的成活率和質(zhì)量增加率：

成活率/%=(n1/n)×100%

質(zhì)量增加率/%=(m2-m1)/m1×100%

式中，n為蟹總數(shù)量，n1為生殖蛻殼后的存活數(shù)量，m1為生殖蛻殼前的體質(zhì)量，m2為生殖蛻殼后體質(zhì)量。

1.3.2 卵巢指數(shù)和組織學(xué)

試驗過程中，根據(jù)中華絨螯蟹完成生殖蛻殼的時間，每5～10 d解剖1次。解剖后取出每只蟹的全部卵巢，電子天平稱量質(zhì)量(精確至0.01 g)后計算卵巢指數(shù)。

卵巢指數(shù)/%=m3/m×100%

式中，m為蟹體質(zhì)量，m3為卵巢質(zhì)量。

對波恩氏液固定的卵巢組織進行常規(guī)石蠟切片，切片厚度5.0～7.0 μm，蘇木精—伊紅染色后中性樹膠封片，隨后在顯微鏡下進行觀察(Leica DM2500，德國徠卡公司)，并采用自動數(shù)碼攝像系統(tǒng)(Leica DFC295)進行拍照和圖片處理。參考文獻[10-11]的分期方法將中華絨螯蟹卵巢進行分期，并在顯微鏡下統(tǒng)計切片上15～20個卵細胞的卵徑。各期的組織學(xué)特征為：Ⅰ期，卵巢內(nèi)的主要細胞類型卵原細胞和卵黃合成前卵母細胞，細胞質(zhì)呈嗜堿性；Ⅱ期，卵巢內(nèi)可見大量橢圓形的內(nèi)源性卵黃合成期卵母細胞(EN)，細胞質(zhì)呈嗜堿性；Ⅲ期，卵巢內(nèi)主要細胞類型是外源性卵黃合成期卵母細胞(EX)，胞質(zhì)嗜堿性減弱并向嗜酸性轉(zhuǎn)變；Ⅳ期，卵巢內(nèi)為不規(guī)則的近成熟期卵母細胞(NO)，胞質(zhì)呈嗜酸性，且胞質(zhì)內(nèi)含有大顆粒卵黃物質(zhì)；Ⅴ期，卵巢內(nèi)為成熟卵母細胞(MO)，卵黃顆粒較大且較均勻分布在整個細胞內(nèi)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析, 用Levene法進行方差齊性檢驗，當(dāng)數(shù)據(jù)不滿足齊性方差時對百分比數(shù)據(jù)進行反正弦或者平方根處理，對試驗結(jié)果進行單因子方差分析, 采用Tukey s-b(K)法進行多重比較；當(dāng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后仍不滿足齊性方差時，采用Games-Howell非參數(shù)檢驗進行多重比較。P<0.05為差異顯著, 在Excel軟件上繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié) 果

2.1 雌體生殖蛻殼后的質(zhì)量增加率和成活率的變化

對雌體生殖蛻殼后的質(zhì)量增加率和成活率進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在本試驗條件下生殖蛻殼后雌體的平均質(zhì)量增加率為(54.60±4.93)%；而平均成活率為(71.11±3.85)%。

2.2 雌體生殖蛻殼后的卵巢指數(shù)和卵徑的變化

中華絨螯蟹雌體在生殖蛻殼后20 d內(nèi)卵巢發(fā)育較為緩慢(圖1)。其中在中華絨螯蟹生殖蛻殼后10 d，雌體的平均卵巢指數(shù)為(0.45±0.02)%，而生殖蛻殼后20 d的雌體平均卵巢指數(shù)為(1.48±0.05)%。隨著養(yǎng)殖的進行，卵巢發(fā)育進入快速階段，生殖蛻殼后30 d雌體的平均卵巢指數(shù)為(2.05±0.21)%，至生殖蛻殼后40 d，雌體平均卵巢指數(shù)已顯著增至(2.53±0.72)%。隨著卵巢的進一步發(fā)育，待生殖蛻殼后50 d，雌體的平均卵巢指數(shù)已為(6.83±0.51)%。至生殖蛻殼后60 d，雌體卵巢指數(shù)進一步增至(7.43±0.23)%。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹雌體的卵巢指數(shù)和生殖蛻殼后的時間呈顯著正相關(guān)(P<0.05,n=19)。兩者之間為冪函數(shù)關(guān)系(y=0.3448e0.0565x,r2=0.90)。就卵母細胞長徑而言，中華絨螯蟹卵母細胞長徑與其生殖蛻殼后的時間亦呈顯著正相關(guān)，待生殖蛻殼后60 d時, 雌體卵母細胞的長徑可高達280 μm，兩者之間為冪函數(shù)關(guān)系(y=29.328e0.0424x,r2=0.78)(圖2)。

圖2 群體養(yǎng)殖中華絨螯蟹雌體生殖蛻殼后卵母細胞長徑的變化

2.3 雌體生殖蛻殼后的卵巢組織學(xué)變化

組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹生殖蛻殼后10 d的卵巢處于卵巢發(fā)育的Ⅱ期早期，卵巢中的細胞類型為卵黃合成前卵母細胞(PRO)和內(nèi)源性卵黃合成期卵母細胞(EN)(圖3a)。生殖蛻殼后20 d的雌體卵巢亦處于卵巢發(fā)育的Ⅱ期，但卵巢中的主要細胞類型已轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)源性卵黃合成期卵母細胞(圖3b)。隨后，卵巢進入快速發(fā)育時期，生殖蛻殼后30 d雌體的卵巢發(fā)育至Ⅲ期，卵巢中的主要細胞類型為外源性卵黃合成期卵母細胞(EX)(圖3c)。至生殖蛻殼后40 d的卵巢中的細胞類型仍為外源性卵黃合成期卵母細胞(圖3d)。待生殖蛻殼后50 d，雌體的卵巢已經(jīng)發(fā)育至Ⅳ期，卵巢中的細胞類型為近成熟期卵母細胞(NO)(圖3e)。至生殖蛻殼后60 d，可觀察到近成熟期卵母細胞內(nèi)的卵黃物質(zhì)進一步均質(zhì)化(圖3f)。

圖3 群體養(yǎng)殖中華絨螯蟹雌體生殖蛻殼后卵巢組織學(xué)的變化

3 討 論

3.1 雌體生殖蛻殼后的質(zhì)量增加率和成活率的變化

甲殼動物的生長是通過周期性的蛻殼來實現(xiàn)的，而生殖蛻殼是蟹類由亞成體到成體階段的最后一次蛻殼[3,6-7]。本研究結(jié)果表明，室內(nèi)聚乙烯桶養(yǎng)雌體生殖蛻殼后的平均成活率為71.11%，其高于土池養(yǎng)殖中華絨螯蟹[12]生殖蛻殼后成活率(59.2%)。此外，本試驗中每隔8 h觀察一次，發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹蛻殼后立即將其保護起來，也保證了中華絨螯蟹生殖蛻殼后的成活率。本試驗中中華絨螯蟹生殖蛻殼后的平均質(zhì)量增加率為54.60%，這與土池養(yǎng)殖中華絨螯蟹[12]的質(zhì)量增加率接近。

3.2 雌體生殖蛻殼后的卵巢指數(shù)和卵徑、卵巢組織學(xué)的變化

甲殼動物的卵巢發(fā)育過程非常復(fù)雜，其受到溫度、鹽度、光照周期和餌料等多種因素的綜合調(diào)控[13-14]。一般認(rèn)為生殖蛻殼是蟹類卵巢發(fā)育的起點，生殖蛻殼后蟹類卵巢開始快速發(fā)育[12,15-16]。本試驗結(jié)果表明，中華絨螯蟹雌體在生殖蛻殼后20 d內(nèi)卵巢內(nèi)的卵母細胞類型主要為內(nèi)源性卵黃合成期卵母細胞，且卵巢指數(shù)增長緩慢，這可能是因為：(1)中華絨螯蟹雌體剛剛生殖蛻殼后，需要完成從內(nèi)源性卵黃合成期到外源性卵黃合成期的轉(zhuǎn)變，濾泡細胞遷移到卵母細胞四周需要一個過程[11]；(2)剛剛生殖蛻殼后的中華絨螯蟹雌體需要優(yōu)先在肌肉和肝胰腺中積累較多的營養(yǎng)物質(zhì)，才能保證其后續(xù)正常卵巢發(fā)育[17]。隨著養(yǎng)殖的進行，卵巢發(fā)育進入快速階段，卵母細胞由內(nèi)源性卵黃合成期卵母細胞發(fā)育為近成熟期卵母細胞，且卵巢指數(shù)急劇增加。

綜上，本試驗進一步探明了中華絨螯蟹雌體生殖蛻殼后的卵巢發(fā)育規(guī)律，這為中華絨螯蟹養(yǎng)殖管理、育肥和捕撈上市等提供基礎(chǔ)資料和實踐依據(jù)。中華絨螯蟹生殖蛻殼后20 d內(nèi)卵巢發(fā)育較為緩慢，隨后進入快速發(fā)育階段，因此在今后的中華絨螯蟹養(yǎng)殖管理中，在中華絨螯蟹生殖蛻殼后的一段時間內(nèi)應(yīng)投喂足量的餌料以滿足中華絨螯蟹后續(xù)的卵巢發(fā)育需求。此外，筆者通過規(guī)律間斷采樣探明中華絨螯蟹雌體生殖蛻殼后的卵巢發(fā)育規(guī)律，為今后科研工作中選擇不同卵巢發(fā)育階段的中華絨螯蟹雌體提供了參考資料。

4 結(jié) 論

將體質(zhì)量為50～70 g的中華絨螯蟹雌蟹亞成體在室內(nèi)放置遮蔽物的聚乙烯水桶中養(yǎng)殖至生殖蛻殼后，取出30只雌體繼續(xù)養(yǎng)殖60 d發(fā)現(xiàn)，卵巢指數(shù)和生殖蛻殼后的時間呈顯著正相關(guān)，兩者之間為冪函數(shù)關(guān)系(y=0.3448e0.0565x,r2=0.90)，卵母細胞長徑與其生殖蛻殼后的時間亦呈顯著正相關(guān)，兩者之間為冪函數(shù)關(guān)系(y=29.328e0.0424x,r2=0.78)。