王 旭，馮春明，孫述好，羅永成

( 1.遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東 118003； 2.遼東學(xué)院 海岸帶生物技術(shù)研究所，遼寧 丹東 118003； 3.丹東市漁業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 丹東 118000 )

水霉病具有高傳染性、高發(fā)病率及高死亡率等特點，各種淡水成魚、魚苗和魚卵都可發(fā)生，是淡水養(yǎng)殖魚類的世界性病害[1-2]。該病病原為水霉屬(Saprolegnia)真菌[3]。其中，寄生水霉(S.parasitica)是目前已發(fā)現(xiàn)的致病水霉中最為重要的病原菌，其孢子萌發(fā)快，侵襲能力強，幾乎能夠感染包括鱘魚、鯽魚(Carassiusauratus)、斑馬魚(Daniorerio)等在內(nèi)的所有淡水魚類及魚卵[4-7]。孔雀石綠曾是治療水霉病最有效的化學(xué)試劑，但因其強致畸、致癌及高殘留等缺點，已被禁止使用。目前水霉病防治主要采用抗生素、殺菌劑、中草藥、氧化劑等[8-14]。這些方法易造成水霉的耐藥性，且存在效果不明顯、成本高，使用受限，有效含量超出安全限量等問題[15]。研究表明，一些微生物來源的活性成分可以抑制真菌的生長和感染，且具有綠色、環(huán)保、安全、高效的優(yōu)點[16-17]。筆者以寄生水霉為靶標(biāo)菌，通過平板對峙培養(yǎng)，篩選對水霉生長具有抑制作用的菌株，并對其抑菌穩(wěn)定性進行初步研究，以期為水霉病的生物防治提供優(yōu)良菌種資源和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

寄生水霉菌株SMJ-1、SMJ-2、SMJ-3、SMJ-4分離自遼寧省東港市淡水養(yǎng)殖池塘的散鱗鏡鯉(Cyprinuscarpiovar.specularis)、彭澤鯽(Carassiusauratusvar.pengze)、大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)的發(fā)病組織及散鱗鏡鯉魚卵。經(jīng)純化、致病性測定和分子鑒定，確定其均為寄生水霉[18]。待篩選菌株為分離自丹東地區(qū)淡水養(yǎng)殖池塘周圍土壤樣品中的21株放線菌。所有菌株均保存于遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院微生物工程實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基

放線菌培養(yǎng)采用高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g，硝酸鉀1.0 g，氯化鈉0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20.0 g，水1000 mL，pH 7.2。水霉培養(yǎng)和平板對峙試驗采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、水1000 mL，自然pH。

1.1.3 拮抗菌基因組DNA提取及16S rRNA基因序列擴增試劑

Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、Premix Taq Version 2.0(Loading dye mix)、DNA Marker(DL-2000)購自寶生物工程(大連)有限公司；引物1492R/27F(1492R：5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′，27F：5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌篩選

采用平板對峙法進行初步篩選，用接種鏟將1.1.1中純化的寄生水霉接種于PDA平板中央進行活化，18 ℃培養(yǎng)3 d后，用直徑0.6 cm的無菌打孔器制備菌餅，接種于PDA平板中央，18 ℃培養(yǎng)24 h后，采用十字交叉法，在距離靶標(biāo)菌餅2 cm處對稱點接待篩選菌株，以不接菌一側(cè)為對照(圖1)。置于18 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至對照一側(cè)長滿平板后測量抑菌帶寬度，確定待篩菌株的抑菌效果。

采用發(fā)酵液抑菌試驗確定其抑菌率，初篩所得拮抗菌株接種于裝量40%的高氏一號液體培養(yǎng)基中，25 ℃發(fā)酵72 h。發(fā)酵液經(jīng)細菌濾器過濾后，按照1∶5的比例與55 ℃的PDA培養(yǎng)基混合均勻，制備平板。冷卻后，在平板中央接種寄生水霉菌餅，設(shè)無菌水為對照，每個處理3個平行，于18 ℃培養(yǎng)4 d后測量各處理的菌落直徑，計算抑菌率。

抑菌率/%=(d1-d2)/d1×100%

式中，d1為對照菌落生長直徑，d2為處理菌落生長直徑。

1.2.2 拮抗菌鑒定

拮抗菌形態(tài)特征測定參照文獻[19-20]的方法進行。拮抗菌16S rRNA基因序列分析方法如下：將待測菌株接種在高氏一號平板培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3 d，用滅菌的槍頭刮取適量菌體置于50 μL菌體裂解液Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR中，80 ℃水浴15 min，5000 r/min離心5 min，取上清液作為PCR模板。選用通用引物27F:5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′和1492R：5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′進行16S rRNA基因序列擴增。擴增體系為：1×Taq PCR Master Mix 25 μL，DNA模板2 μL(1～10 ng)，引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，2 min，30個循環(huán)；72 ℃，10 min，4 ℃終止反應(yīng)。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，由生工生物工程(上海)有限公司進行純化、測序拼接。獲得的基因序列在美國國立生物技術(shù)信息中心(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)進行Blast檢測，下載同源性較高的菌種序列信息。利用軟件MEGA X 10.0.2進行多重序列比對，并采用鄰接法進行1000次步長計算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 拮抗菌傳代穩(wěn)定性測定

拮抗菌株于高氏一號培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，每48 h轉(zhuǎn)接1次，連續(xù)傳代10次，每個處理3個平行。平板對峙試驗測定出發(fā)菌株與傳代菌株對寄生水霉的抑菌效果，根據(jù)抑菌帶寬度變化分析傳代對拮抗菌抑菌效果的影響。

1.2.4 拮抗菌發(fā)酵液熱穩(wěn)定性測定

拮抗菌發(fā)酵采用高氏一號液體培養(yǎng)基，試驗菌株菌液以5%的接種量接種于裝量為40%的500 mL三角瓶中，30 ℃，120 r/min，培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液采用無菌濾膜過濾，濾液4 ℃冷藏備用。

各取發(fā)酵濾液15 mL分別加入到20 mL直口離心管中，置于10、20、30、40、50、60、70 ℃下處理 2 h。之后按照1∶5的比例，將處理后的發(fā)酵濾液分別與滅菌后冷卻至55 ℃的PDA培養(yǎng)基混合均勻制備平板。每個平板中央接種寄生水霉菌餅，每個處理3個平行，18 ℃培養(yǎng)至對照長滿平板后，測量各處理菌落直徑，計算抑菌率，檢測不同溫度處理對試驗菌株發(fā)酵濾液抑菌活性的影響。

1.2.5 拮抗菌發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性測定

拮抗菌無菌發(fā)酵濾液制備方法同1.2.4。各取發(fā)酵濾液15 mL分別加入到20 mL直口離心管中，用1 mol/L HCl和1mol/L NaOH分別調(diào)整pH至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，室溫靜置24 h后，將各管中的pH調(diào)回至未經(jīng)處理的發(fā)酵濾液pH 6.8。之后按照1∶5的比例，將處理后的發(fā)酵濾液分別與滅菌后冷卻至55 ℃的PDA培養(yǎng)基混合均勻制備平板。每個平板中央接種寄生水霉菌餅，不經(jīng)處理的發(fā)酵濾液作為對照，每個處理3個平行，18 ℃培養(yǎng)至對照長滿平板后，測量各處理菌落直徑，計算抑菌率，檢測不同pH處理對試驗菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選

平板對峙試驗結(jié)果顯示，菌株FX17對4株不同來源的寄生水霉菌株SMJ-1、SMJ-2、SMJ-3、SMJ-4均表現(xiàn)出顯著拮抗作用，其中抑菌帶平均寬度最大為(25.40±0.13) mm(圖1)。發(fā)酵液抑菌試驗結(jié)果顯示，菌株FX17的抑菌率達73.20%。

圖1 菌株FX17對寄生水霉的拮抗作用

2.2 拮抗菌鑒定

2.2.1 拮抗菌FX17的形態(tài)特征

菌株FX17在高氏一號培養(yǎng)基上菌落微黃白色、干燥，培養(yǎng)基背面微黃色，氣生菌絲微黃白色，基內(nèi)菌絲無色，無色素(圖2)。孢子絲多個螺旋形，孢子卵圓形、表面光滑(圖3)。對照《放線菌的分類與鑒定》和《鏈霉菌鑒定手冊》，菌株FX17的形態(tài)與鏈霉菌屬(Streptomyces)特征一致。

圖3 菌株 FX17的孢子絲

圖2 菌株FX17的菌落形態(tài)

2.2.2 拮抗菌FX17的16S rRNA基因序列分析

以菌株FX17的基因組DNA為模板，1492R/27F為通用引物，經(jīng)PCR擴增、測序獲得長度為1443 bp的堿基序列(GenBank登錄號：MN548370)。所測序列在美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中進行Blast檢索，結(jié)果顯示，該菌株與鏈霉菌屬細菌S.triostinicus的16S rRNA基因序列相似性為99.42%。選取并下載典型菌株序列，以小單孢菌屬種類Micromonosporaviridifaciens為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，菌株FX17與S.triostinicus聚類在一個分支上，兩者同源性達99%，顯示出較近的親緣關(guān)系，因此鑒定菌株FX17為S.triostinicus。

圖4 基于菌株FX17的16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 拮抗菌FX17傳代穩(wěn)定性測定

拮抗菌S.triostinicusFX17和其傳代菌株分別與寄生水霉進行平板對峙培養(yǎng)，結(jié)果顯示，拮抗菌S.triostinicusFX17繼代培養(yǎng)菌株與出發(fā)菌株之間抑菌效果差異不顯著(P>0.05)(表1)，說明該拮抗菌抑菌效果傳代穩(wěn)定。

表1 拮抗菌S. triostinicus FX17及其繼代培養(yǎng)菌株對寄生水霉的抑制作用

2.4 溫度變化對拮抗菌FX17發(fā)酵液抑菌活性的影響

溫度變化對拮抗菌S.triostinicusFX17發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的影響結(jié)果見圖5，10～70 ℃內(nèi)處理的樣品其抑菌活性無顯著性差異(P>0.05)，表明溫度變化對拮抗菌S.triostinicusFX17發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)的活性沒有影響，該菌株發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)對溫度變化具有良好的耐受性。

圖5 不同溫度處理對拮抗菌S. triostinicus FX17發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.5 拮抗菌FX17發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性

pH變化對拮抗菌S.triostinicusFX17發(fā)酵液抑菌活性的影響結(jié)果見圖6，試驗菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性對酸堿度變化較為敏感，pH低于6.0或高于8.0，抑菌率顯著下降，僅在pH 6.0～8.0內(nèi)抑菌活性較為穩(wěn)定，表明拮抗菌S.triostinicusFX17發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的活性受pH影響較大，在pH 6.0～8.0內(nèi)抑菌作用穩(wěn)定。

圖6 不同pH處理對拮抗菌S. triostinicus FX17發(fā)酵液抑菌活性的影響

3 討 論

3.1 水霉拮抗菌的篩選

以化學(xué)藥物、抗生素、疫苗以及中草藥等方法防治水霉病存在各自的缺點和不足。利用拮抗菌及其發(fā)酵產(chǎn)物對水霉病進行防治具有綠色、環(huán)保、安全、高效的優(yōu)點，已成為水霉病防控研究的主流方向[4]。研究表明，一些細菌如芽孢桿菌(Bacillus)和放線菌(Actinomyces)對水霉菌具有良好的抑制作用。張書俊等[21]篩選獲得1株對水霉菌菌絲體生長與孢子萌發(fā)具有明顯抑制作用的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)LD038。賀鳳等[22]從海底沉積物中分離、篩選水霉拮抗菌株海洋鏈霉菌(Streptomycessp.)S26，其產(chǎn)生的活性物質(zhì)對病原水霉真菌有較強的抑制作用，并對外界環(huán)境變化有較強的適應(yīng)能力。梁永增等[23-24]篩選的芽孢桿菌(Bacillussp.)JL04和短小芽孢桿菌(B.pumilus)JL50對水霉菌均具有顯著抑制作用，且兩株拮抗菌對魚體沒有毒性，傳代穩(wěn)定。筆者自實驗室分離保存的21株放線菌中篩選獲得一株對寄生水霉具有顯著拮抗作用的鏈霉菌菌株FX17。試驗結(jié)果表明，該菌株對不同來源的寄生水霉均顯示出明顯的抑制作用。經(jīng)過對其形態(tài)學(xué)特征及16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析可知，菌株FX17與S.triostinicus具有較近的親緣關(guān)系。此前，S.triostinicus對寄生水霉的拮抗作用未見報道。

3.2 拮抗菌S. triostinicus FX17的抑菌穩(wěn)定性及適應(yīng)性

拮抗菌S.triostinicusFX17經(jīng)傳代培養(yǎng)后，對水霉菌拮抗作用穩(wěn)定，表明其具有良好的傳代穩(wěn)定性。該菌發(fā)酵濾液經(jīng)10～70 ℃低溫及高溫處理后，抑菌活性穩(wěn)定，表明其發(fā)酵液抑菌活性成分能耐受高溫，可以推測，拮抗菌S.triostinicusFX17所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為非蛋白類代謝物。這一結(jié)果與賀鳳等[22]關(guān)于海洋鏈霉菌株S26的拮抗物質(zhì)活性成分分析結(jié)果一致。淡水養(yǎng)殖水體的溫度變化通常為0～34.6 ℃[25]，試驗表明，拮抗菌S.triostinicusFX17發(fā)酵產(chǎn)物表現(xiàn)出對養(yǎng)殖環(huán)境溫度變化的良好適應(yīng)性。該菌的發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性對環(huán)境的pH波動較為敏感，僅在pH 6～8內(nèi)具有顯著的抑菌效果。通常，淡水養(yǎng)殖水體的pH變化為6.8～8.5[26]，可見該菌的發(fā)酵產(chǎn)物在淡水養(yǎng)殖水體中應(yīng)用具有較好的酸堿適應(yīng)性。

4 結(jié) 論

綜上所述，拮抗菌S.triostinicusFX17在平板對峙試驗及發(fā)酵液抑菌試驗中均對水霉病常見病原菌寄生水霉具有顯著拮抗作用，并表現(xiàn)出良好的傳代穩(wěn)定性。該菌株發(fā)酵液中的抑菌活性成分具有良好的熱穩(wěn)定性，推測為非蛋白類物質(zhì)，且在淡水養(yǎng)殖水體的pH變化范圍內(nèi)抑菌活性穩(wěn)定，表明拮抗菌S.triostinicusFX17所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有開發(fā)成為水霉病生防制劑的潛在價值。