馮 蘭，安添午，崔鵬飛，趙曉東，李華德，付 雪，張 蘭，翟亞如，李 豪，晏文俊，王紅寧，楊 鑫

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610065； 2. 四川省草原科學(xué)研究院，成都 610097)

1 引 言

牦牛是生活在高海拔地區(qū)的哺乳動(dòng)物，主要分布在中國、俄羅斯、尼泊爾和蒙古.牦牛全球總數(shù)約1 420萬頭，95%生活在中國，其中四川省阿壩藏族自治州牦牛存欄量約為152萬頭.由于高原地區(qū)獨(dú)特的生境，且不同高原物種共享同一生態(tài)資源，致使病原菌的種間傳播風(fēng)險(xiǎn)更高，牦牛更易感染各類疾病[2].其中，腹瀉是導(dǎo)致牦牛高死亡率的主要因素[3].

沙門氏菌是一種嚴(yán)重危害動(dòng)物和人類健康的病原菌，在人類[5]、豬[6]、雞[7]、牛[8]、駱駝[9]、羊[10]等中均曾有過沙門氏菌病爆發(fā)的記錄.自1885年首次被分離出來，沙門氏菌血清型已發(fā)展到2 637種[11].部分血清型僅能感染一種或兩種特定宿主，例如雞白痢沙門氏菌僅以雞為宿主[12]，德爾卑沙門氏菌多以豬，雞以及人類為宿主[13].其余大部分血清型沙門氏菌具有廣泛的感染對(duì)象.在中國，流行的沙門氏菌血清型眾多，包括鼠傷寒沙門氏菌[14]、副傷寒沙門氏菌[15]、腸炎沙門氏菌[16]、及德爾卑沙門氏菌[17]等.在中國四川西部及青藏高原等特殊生境，沙門氏菌也有著較長的流行歷史.自1958年甘肅牧區(qū)馬場爆發(fā)沙門氏菌病以來[18]，有關(guān)沙門氏菌感染藏系物種的報(bào)道越來越多，其中牦牛沙門氏菌尤甚.調(diào)查發(fā)現(xiàn)，感染牦牛的沙門氏菌以都柏林沙門氏菌、病牛沙門氏菌以及紐波特沙門氏菌為主.本研究首次從腹瀉牦牛體內(nèi)分離得到德爾卑沙門氏菌ST71，并研究了德爾卑沙門氏菌的致病性，對(duì)牦牛腹瀉病的防控具有實(shí)際指導(dǎo)意義.

2 材料和方法

2.1 材 料

PBS(上海源葉生物科技有限公司)、三氯甲烷(成都華耀化工有限公司)、異丙醇(四川綠森林化工有限公司)、DEPC水(Biosharp)、75%乙醇、95%乙醇、TRIZol(Invitrogrn)、TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(生產(chǎn)廠家)、Taq Master Mix(成都擎科生物科技有限公司)、DNA marker2000(成都擎科生物科技有限公司)、病毒引物(成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司)、BHI培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)、BPW培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)、MM培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)、M-H培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)、XLT4培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)、50%丙三醇(成都科龍化工試劑廠)、生理鹽水、Taq Master Mix(成都擎科生物科技有限公司)、ddH2O、TR101沙門氏菌屬診斷血清(寧波天潤生物藥業(yè)有限公司)、細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)、藥敏紙片(杭州微生物制劑有限公司)、4～6周齡，體重18～20 g Balb/C雄性小鼠36只(四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)、生理鹽水、50%動(dòng)物組織固定液(成都里來生物科技有限公司)、超純水、小鼠滅菌飼料(成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司).

2.2 方 法

2.2.1 樣本采集 2017年，于四川省紅原縣龍日壩鄉(xiāng)四所養(yǎng)殖場采集腹瀉牦牛新鮮糞便16份.采用滅菌棉簽取腹瀉糞樣5～6 g于10 mL Eppendorf滅菌試管中,進(jìn)行編號(hào)整理后置于4 ℃冰箱冷藏保存，采樣工作結(jié)束后48 h內(nèi)帶回四川省動(dòng)物疫病防控與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開展后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.2.2 病毒PCR檢測 所有樣本均進(jìn)行牛腹瀉相關(guān)病毒的檢測，共計(jì)檢測7種病毒：牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛腸道病毒(BEV)、牛冠狀病毒(BCoV)、牛圓環(huán)病毒(BToV)、牛輪狀病毒(BRV)、牛星形病毒(BAstV)和牛諾如病毒(BNoV)，引物序列如表1所示.

2.2.3 細(xì)菌的分離鑒定 取糞樣1 g于5 mL PBS中振蕩混勻，使用緩沖蛋白胨水(BPW，8～18 h，37 ℃，180 r/min)和Rappaport's肉湯(MM，18～24 h，37 ℃，180 r/min)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)富集，于XLT4選擇性培養(yǎng)基(37 ℃，24 h)初篩，分離菌革蘭氏染色鏡檢.隨后用BD-Phoenix-100系統(tǒng)(bekton-Dickinson)對(duì)分離的菌株進(jìn)行全物種鑒定，并用16S rDNA引物27F和1492R (27F: 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′; 1492R: 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR鑒定.PCR產(chǎn)物送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序.利用NCBI數(shù)據(jù)庫，采用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)對(duì)PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果進(jìn)行分析.

表1 牛腹瀉相關(guān)病毒引物Tab.1 Primer sequences of bovine diarrhea viral

2.2.4 藥物敏感性實(shí)驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法測定菌株的耐藥表型，并根據(jù)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn); 第二十三版資料增刊(CLSI)的要求，在Mueller-Hinton瓊脂平板上對(duì)19種抗生素進(jìn)行檢測：氯霉素(C；30 μg)、四環(huán)素(TE；30 μg)、頭孢噻呋(EFT；30 μg)、阿莫西林(AMC；30 μg)、氨芐西林(AMP；10 μg)、頭孢他啶(CAZ；30 μg)、復(fù)方新諾明(SXT；1.25+23.75 μg)、環(huán)丙沙星(CIP；5 μg)、頭孢曲松(CRO；30 μg)、氟苯尼考(FFC；30 μg)、亞胺培南(IPM；10 μg)、諾氟沙星(NOR；10 μg)、多西環(huán)素(DO；30 μg)、阿米卡星(AMK；30 μg)、氨曲南(ATM；30 μg)、多粘菌素(PB；300 units)、慶大霉素(CN；10 μg)、磷霉素(FOS；200 μg)、替加環(huán)素(TGC；15 μg).根據(jù)CLSI推薦的臨床解釋標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，多粘菌素和替加環(huán)素采用歐洲抗菌藥物敏感試驗(yàn)委員會(huì)關(guān)于抗菌藥物敏感試驗(yàn)的技術(shù)說明進(jìn)行結(jié)果判讀.

2.2.5 多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing，MLST) 采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)提取沙門氏菌DNA，對(duì)沙門氏菌的7對(duì)管家基因(aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、thrA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列以及擴(kuò)增片段大小如表2所示.PCR產(chǎn)物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序.使用Enterobase(http://enterobase.warwick.ac.uk/)對(duì)序列進(jìn)行分析并得到最終分型結(jié)果.

表2 沙門氏菌管家基因引物序列Tab.2 Primer sequence of housekeeping gene of Salmonella

2.2.6 血清型鑒定 沙門氏菌血清型鑒定采用寧波天潤 TR101沙門氏菌屬診斷血清(60種)試劑盒.選擇潔凈消毒的載玻片作為血清凝集反應(yīng)發(fā)生載體，并選取干凈黑色桌面作為背景以便于清晰觀察.隨后進(jìn)行血清凝集，觀察凝集情況，于1 min內(nèi)觀察其是否出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象并逐一記錄.

2.2.7 小鼠致病性實(shí)驗(yàn) 4～6周齡，體重18～20 g Balb/C雄性小鼠36只購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，將小鼠置于25±2 ℃的溫度下，在12 h的光/暗循環(huán)下進(jìn)行為期7 d的馴化.通過構(gòu)建沙門氏菌OD600與活菌數(shù)量線性回歸方程，計(jì)算37 ℃ 160 r/min恒溫?fù)u床過夜培養(yǎng)的沙門氏菌濃度，并逐步梯度稀釋至105～109CFU/mL備用.將馴化良好的小鼠隨機(jī)分為6組，6只/組(編號(hào)A-F)，選取分離株15XLR進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，A組小鼠腹腔注射生理鹽水0.2 mL(0.2 mL/10 g)作為陰性對(duì)照，B-F組依次注射0.2 mL濃度為105～109CFU/mL沙門氏菌菌液.每日監(jiān)測其健康狀況，連續(xù)監(jiān)測7日，觀察是否出現(xiàn)典型腹瀉癥狀(精神不適，進(jìn)行性虛弱、厭食、低頭和腹瀉).本實(shí)驗(yàn)采用Reed-Muench法計(jì)算牦牛德爾卑沙門氏菌LD50值.計(jì)算方法如下:

距離比例=(高于50%的死亡率-50%)/(高于50%的死亡率-低于50%的死亡率)

lgLD50=高于50%死亡率細(xì)菌稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例 稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)

對(duì)死亡小鼠立即解剖，取肺臟，脾臟，肝臟，回腸，盲腸，結(jié)腸各3 g于5 mL PBS中洗滌后保存于動(dòng)物組織固定液中，由成都里來生物公司進(jìn)行病理切片制作.

3 結(jié) 果

3.1 細(xì)菌的分離與鑒定

經(jīng)檢測，所有樣本中，被檢測7種病毒均為陰性，表明本次牦牛腹瀉并非由病毒感染導(dǎo)致.自XLT4選擇性培養(yǎng)基分離到菌落.菌落整體較為濕潤且具有良好的光澤度形態(tài)呈黑色濕潤圓狀，直徑較小，約1～2 mm.隨后的BD-Phoenix-100系統(tǒng)和16S-PCR結(jié)果表明，從XLT4培養(yǎng)基中分離出的16株菌株均為沙門氏菌.

3.2 沙門氏菌多位點(diǎn)序列分型及血清型鑒定

Enterobase數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，16株沙門氏菌的7對(duì)管家基因等位基因序號(hào)均為：thrA:36、purE:29、sucA:9、hisD:36、aroC:39、hemD:8、dnaN:35.MLST型均為ST71.MLST分型結(jié)果相同表示分離菌屬于相同的克隆.對(duì)分離得到的16株沙門氏菌進(jìn)行血清凝集反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果表明，所有被檢測沙門氏菌均為德爾卑沙門氏菌(S.Derby)(([1]，4，[5]，12: f，g: [1,2])).

3.3 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示所有分離株均對(duì)阿莫西林、頭孢他啶、磺胺甲惡唑、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、氟苯尼考、亞胺培南、諾氟沙星、強(qiáng)力霉素、阿米卡星、氨曲南、多粘菌素、慶大霉素、磷霉素、替加環(huán)素敏感，同時(shí)對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、氯霉素和頭孢噻呋4種抗生素多重耐藥(表3).

表3 牦牛沙門氏菌分離株藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Antimicrobial susceptibility patterns for 16Salmonella isolates from yaks with diarrhea in Hongyuan，Tibetan Qiang Autonomous Prefecture of Ngawa，China

3.4 小鼠致病性實(shí)驗(yàn)

3.4.1 半致死劑量測定 由于菌株源自相同克隆，本研究選取腹瀉最為嚴(yán)重糞樣15XLR分離株開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn).通過計(jì)算動(dòng)物存活率，沙門氏菌15XLR在Balb/C小鼠體內(nèi)的致病性進(jìn)行了測定.結(jié)果表明，分離的德爾卑沙門氏菌15XLR在106CFU/mL時(shí)具有致死能力，在109CFU/mL時(shí)致死率為100%(表4)，根據(jù)Reed-Muench法，計(jì)算得到半致死劑量(LD50)為1.2×107CFU.

表4 不同劑量德爾卑沙門氏菌對(duì)小鼠致死情況Tab.4 The statistics of death mice by different dose of S. Derby

3.4.2 病理切片觀察 蘇木精-伊紅(HE)染色結(jié)果顯示小鼠脾白髓內(nèi)有散在的小壞死灶.淋巴細(xì)胞明顯凋亡或壞死，有核溶解或碎裂現(xiàn)象，細(xì)胞腫脹和解體，實(shí)質(zhì)淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，紅髓面積比例相對(duì)增加.腸道組織內(nèi)可見大量病變，腸結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞.腸粘膜細(xì)胞有明顯增生，腸粘膜嚴(yán)重局灶性壞死.細(xì)胞解體，壞死區(qū)周圍可見少量炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，腸腺萎縮.腸黏膜局灶性壞死，炎性細(xì)胞浸潤等病理變化提示受試小鼠免疫功能和消化功能下降(圖1).

4 討 論

牦牛沙門氏菌病在牧區(qū)長期流行，有關(guān)該病的報(bào)道最早可追溯到1958年在甘肅山丹馬場爆發(fā)過的沙門氏菌病，引起嚴(yán)重的牛群死亡，尤以感染犢牛為甚[18].牧區(qū)流行的沙門氏菌血清型主要為都柏林沙門氏菌與病牛沙門氏菌.對(duì)四川的調(diào)查研究顯示，腹瀉耗牛糞便中主要以都柏林沙門氏菌為主.2011年，朱曉霞等[21]從四川省青藏高原臨床健康耗牛新鮮糞便中分離到31株沙門氏菌，血清型鑒定分別為：御成門沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、布利丹沙門氏菌、斯坦利沙門氏菌、奧雷翁沙門氏菌和紐波特沙門氏菌.2016年孔雪英等人[22]于紅原縣，小金縣以及理縣總共分離得到33株沙門氏菌，鑒定血清為乙型副傷寒沙門氏菌(S.ParatyphiB)，鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)，豬霍亂沙門氏菌(S.Choleraesuis)，丙型副傷寒沙門氏菌(S.ParatyphiC)以及湯卜遜沙門氏菌(S.Thompson).未見德爾卑沙門氏菌感染牦牛的研究報(bào)道.

德爾卑沙門氏菌MLST型主要為ST39、ST40、ST71以及ST368[23]，蔡銀強(qiáng)的研究報(bào)告指出，德爾卑沙門氏菌ST40可對(duì)至少三種抗生素，特別對(duì)四環(huán)素的耐藥表型.相比ST40，ST71則為易感菌株.在2019年Sévellec 等的調(diào)查報(bào)告中表明[25]，143株菌株中有35.7%表現(xiàn)出耐藥表型，其中對(duì)磺胺甲惡唑和四環(huán)素的耐藥率較高(>70%)，對(duì)氟喹諾酮的耐藥率在英國和西班牙分離的德比沙門菌中均有發(fā)現(xiàn).該研究進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ST71極容易產(chǎn)生對(duì)氨基糖苷類、磺胺類和四環(huán)素類抗生素的耐藥性.與Sévellec 等的研究不同，本研究中，ST71菌株對(duì)氯霉素(C)、頭孢噻呋(EFT)、氨芐西林(AMP)和四環(huán)素(TE)四種抗生素均有多重耐藥，分別屬于廣譜抗生素、頭孢菌素和青霉素類.藏區(qū)牦牛沙門氏菌耐藥譜變化，提示牧區(qū)應(yīng)注意抗生素尤其是廣譜抗生素的使用，應(yīng)聯(lián)合用藥，以避免單一用藥造成超級(jí)耐藥沙門氏菌的出現(xiàn).本研究沙門氏菌半致死劑量為1.2×107CFU，與其他血清型沙門氏菌半致死劑量，如與Tennant等[26]等研究的都柏林沙門氏菌(2×104CFU)和斯坦利維爾沙門氏菌(9.1×104CFU)相比，德爾卑沙門氏菌非強(qiáng)毒力菌株，但仍可在一定濃度范圍內(nèi)具有致病及致死能力.