王 晶，黃璐琳，林 嬰，楊正林，，3

(1.中國科學院大學成都生物研究所，中國科學院大學，中國科學院研究生院，四川 成都 610000；2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072；3.中國科學院四川轉(zhuǎn)化研究醫(yī)院，四川 成都 610000)

原發(fā)性開角型青光眼 (primary open-angle glaucoma，POAG) 是最常見的青光眼類型，以眼壓升高、視神經(jīng)頭改變、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞丟失等為主要疾病特征[1，2]。本實驗室在2014年首次發(fā)現(xiàn)了ABCA1和PMM2基因與POAG相關(guān)[2]，2018年關(guān)于眼壓的易感位點研究中發(fā)現(xiàn)有五個位點具有眼部相關(guān)表型[3]。在這些研究的基礎上，結(jié)合其他實驗室對VAV2與POAG相關(guān)性研究的成果[1，4，5]，開展了對VAV2基因與西南漢族人群POAG相關(guān)性的分析。

第一階段SNP基因分型數(shù)據(jù)來源于本實驗室前期全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study，GWAS)結(jié)果[2]。針對收集的病例組和對照組樣本，對VAV2兩個SNP位點(rs7852459，rs2156323)基因分型，通過Meta分析，驗證該基因與POAG的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象研究時間2018年12月至2019年7月，研究對象主要由四川省人民醫(yī)院、上海復旦大學眼科醫(yī)院以及香港眼科醫(yī)院招募。病例組納入標準：前房角開放；發(fā)病(或診斷)年齡≥18歲；兩眼軸向長度≤ 27.0 mm；任何一只眼睛的視野具備特征性青光眼損傷(在可靠的視野)與神經(jīng)纖維層丟失一致等；對照組納入標準包括：眼壓≤21 mmHg；垂直杯盤比≤0.5等。樣本具體納入標準參看文獻[2]

1.2 單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的選擇前期GWAS研究[2](病例組1007例和對照組1009例)得到了一系列候選基因的基因分型初篩結(jié)果，再利用PLINK進行人口分層評估，其中966例POAG病例和1005例對照最終通過了質(zhì)控；隨即采用Logistic回歸對通過質(zhì)量控制的SNPs進行了GWAS分析?；趯蜻x基因中VAV2基因的蛋白功能的初步推測分析，選擇了位于VAV2基因上的SNP位點(rs2156323、rs7852459)以及同一個連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)共7個SNP位點為研究靶點。

1.3 基因分型首先，對位于VAV2基因上的SNP位點(rs2156323、rs7852459)以及同一個連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)共7個SNP位點的GWAS數(shù)據(jù)進行分析，得到了第一階段基因分型結(jié)果，統(tǒng)計分析這些位點的基因分型信號。隨后第二階段，在追加的1021例POAG病例和1012例對照樣本中，采用Sequenom MassARRAY方法，對這7個SNP位點基因分型。

1.4 統(tǒng)計學方法用Hardy-weinberg(HWE)對SNP位點進行檢驗。采用Logistic回歸對經(jīng)過年齡校正的SNP位點與POAG的相關(guān)性進行分析，通過Haploview 4.0進行連鎖不平衡分析，得到r2值。計算合并效應量OR及95%可信區(qū)間。使用Metal軟件包對VAV2基因的GWAS數(shù)據(jù)[2]和Sequenom MassARRAY數(shù)據(jù)進行Meta分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

研究選擇了VAV2基因的2個SNP位點rs7852459、rs2156323及其同一LD(r2> 0.6)的SNP位點進行分析，與rs7852459屬于同一LD的是rs7869522(r2=0.68)，rs62576555(r2=0.67)；與rs2156323屬于同一個LD的是rs10993824(r2=1)，rs72762864(r2=1)，rs10993832(r2=1)。具體分析結(jié)果見表1至表3。

2.1 VAV2基因的rs2156323和rs7852459在第一階段研究中與POAG的關(guān)聯(lián)結(jié)果在第一階段研究中，rs2156323 (G>A)在POAG組和對照組的基因頻率分別為0.11和0.12，在POAG組和對照組之間的差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.29，P=0.13，OR=0.88，95%CI：0.74～1.04)。rs7852459 (G>C) 在POAG組和對照組的基因頻率分別為0.12和0.07，在POAG組和對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=41.48，P=1.19×10-10，OR=1.82，95%CI：1.51～2.18)。見表1。

表1 第一階段VAV2基因rs7852459和rs2156323同一個LD的SNP位點病例對照關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

表2 第二階段VAV2基因rs7852459和rs2156323同一個LD的SNP位點病例對照關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

2.2 VAV2基因的rs2156323和rs7852459在第二階段研究中與POAG的關(guān)聯(lián)結(jié)果在第二階段Sequenom MassARRAY驗證結(jié)果中，rs2156323 (G>A) 在POAG組和對照組的基因頻率分別為0.112和0.113，在POAG組和對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.83，OR=0.98，95%CI： 0.83～1.16)。rs7852459 (G>C) 在POAG組和對照組的基因頻率分別為0.061和0.057，在POAG組和對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.62，OR=1.06，95%CI：0.85～1.32)。見表2。

2.3 VAV2基因的rs2156323和rs7852459兩個位點meta分析結(jié)果Meta分析VAV2基因的兩個SNP位點rs2156323和rs7852459及其同一LD的前兩個階段的結(jié)果表明，rs2156323(G>A) 在POAG組和對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.22，OR=0.93)，rs7852459 (G>C) 在POAG組和對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P=1.67×10-7，OR=1.46)，但異質(zhì)性較大(I >50%)。在此過程中，與rs7852459 (G>C) 同一LD的rs7869522 (A>G) 在Meta分析結(jié)果中表現(xiàn)出POAG組與對照組的顯著差異(P=9×10-5，P(R)=0.04)，同樣也觀察到同一個LD的rs62576555 (C>G)在兩組數(shù)據(jù)的Meta分析結(jié)果中表現(xiàn)出POAG組與對照組的顯著差異(P=1.69×10-7，P(R)=0.19)，表明VAV2基因的rs7852459及其同一LD的兩個SNP位點(rs7869522、rs62576555)與西南漢族人群的POAG具有相關(guān)性。見表3。

表3 VAV2 基因的rs7852459和rs2156323與其同一個LD的SNP位點的Meta分析結(jié)果

3 討論

眼壓被認為是患青光眼的高風險因子，根據(jù)GWAS發(fā)現(xiàn)，TMCO1(1q24.1)的SNPs[6～10]，CAV1/CAV2 (7q31.2)下游的SNPs[7，9，11]，LOC102723944(6p25.3)附近的SNPs[6，8]和ABCA1(9q31.1)[2，6，7，9，11，12]這4個位點被認為是高眼壓和青光眼的共同風險因子。由于青光眼具有一定的遺傳性，目前，POAG在不同種族人群中的易感基因研究仍在進行。

VAV2基因位于9q34.2，全長約225kb，含27個外顯子，表達的蛋白由878個氨基酸組成，大小約為101KD。本次研究選擇的VAV2基因rs2156323(G>A)位點在以往的研究中被證明與日本、印度人群的POAG無明顯相關(guān)性[1，4，5]，而另一個SNP位點rs7852459 (G>C) 的實驗研究數(shù)據(jù)很匱乏。根據(jù)前期第一階段GWAS數(shù)據(jù)得到的基因分型結(jié)果顯示，rs7852459 (G>C) 與POAG有明顯的相關(guān)性(P=1.19×10-10)，并且第一階段分析結(jié)果顯示與之同一LD的rs7869522(P=3.06×10-5)和rs62576555(P=1.77×10-10)與POAG同樣顯著相關(guān)。在第二階段Sequenom MassARRAY驗證結(jié)果中，沒有發(fā)現(xiàn)rs7852459與POAG的相關(guān)性證據(jù)(P=0.62)，推測存在的異質(zhì)性導致與第一階段結(jié)果不一致。而在Meta分析結(jié)果中，rs7852459(P=1.67×10-7)及其同一LD的rs7869522(P=9×10-5)和rs62576555(P=1.69×10-7)均表現(xiàn)出與POAG的顯著相關(guān)性，提示rs7852459及其同一LD的SNP位點作為今后的一個研究靶點，可以補充VAV2基因與POAG發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)的依據(jù)。

綜上，本研究驗證了rs7852459 (G > C)及其同一LD的rs7869522 (A>G) 和rs62576555(C>G)與西南漢族人群POAG顯著相關(guān)，為POAG的遺傳易感性研究提供了一個新的靶點，有進一步探索VAV2基因在POAG致病機制的潛在價值。