李偉民

(河南省鶴壁市人民醫(yī)院心胸外科，河南 鶴壁 458030)

食管癌是常見的發(fā)生于食管上皮組織的惡性腫瘤，其發(fā)病率與死亡率僅次于胃癌、肺癌及肝癌，位居惡性腫瘤第四位[1]。食管鱗癌是食管癌的主要病理類型，約占我國食管癌患者的90%以上，早期食管鱗癌病程較長，癥狀不明顯，不易被發(fā)現(xiàn)，臨床主要采用手術(shù)治療，其5年生存率可高達(dá)90%～100%，然而一旦病情一旦進(jìn)入晚期，病程不到1年，其5年生存率不超過10%[2]，且對于中晚期食管鱗癌患者尚無特效的治療方法，因此，早期、及時(shí)診斷與治療是提高食管鱗癌生存率的關(guān)鍵，需要深入了解食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及疾病機(jī)制，并針對性診斷疾病至關(guān)重要[3]。隨著腫瘤分子生物學(xué)機(jī)制的研究不斷深入，信號分子在食管癌中的作用逐漸受到臨床重視，PD-L1主要表達(dá)于T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，在腫瘤環(huán)境下，其表達(dá)水平會上調(diào)，亦是實(shí)體瘤中表達(dá)的PD-1配體，兩者是免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的協(xié)同刺激分子，能夠抑制淋巴細(xì)胞的增殖、活化，起到免疫負(fù)調(diào)控作用[4]；同時(shí)，既往相關(guān)研究證實(shí)，在多種實(shí)體瘤中，腫瘤浸潤性CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞與患者的生存周期及預(yù)后密切相關(guān)，而指叉頭框蛋白3(FOXP3)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亦能發(fā)揮重要的抑制抗腫瘤作用[5，6]，因此學(xué)者們猜測同時(shí)監(jiān)測CD8+、FOXP3能夠更加準(zhǔn)確的評估腫瘤患者預(yù)后，已有研究證實(shí)CD8+/FOXP3+比值在乳腺癌等腫瘤的表達(dá)及與臨床病理的相關(guān)性[7]。本研究探討食管鱗癌根治術(shù)患者組織中CD8+/FOXP3+比值及PD-L1表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性，為臨床及時(shí)、早期診療食管癌提供分子水平的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料2015年1月至2017年1月我院收治的100例食管鱗癌患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查證實(shí)食管鱗癌；②行根治術(shù)治療；③術(shù)前未接受放療、化療及免疫治療；④預(yù)計(jì)生存期>3月；⑤能夠完成預(yù)后隨訪；⑥經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬同意將標(biāo)本用于本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)禁忌證；②臟器癌患者；③血液系統(tǒng)疾??；④凝血功能障礙；⑤感染性疾?。虎藓喜⑵渌[瘤；⑦自身免疫疾病及全身疾病；⑧心、肝、腎等重要器官嚴(yán)重功能不全或障礙；⑨精神或意識障礙。其中男65例，女35例；年齡35～73歲[(55.96±6.25)歲]；病變位于中上段46例，位于下段53例；高分化30例，中分化39例，低分化31例；TNM分期：T1～260例，T3～440例；N063例，N1～337例；M090例，M110例。

1.2 方法

1.2.1樣本來源 術(shù)中取得癌或癌旁組織1小塊，以生理鹽水及PBS沖洗血跡后置入凍存管液氮速凍，后于-80 ℃低溫保存。

1.2.2試劑 免疫組織化學(xué)SP試劑盒、免抗人CD8單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)、免抗人FOXP3單克隆抗體(英國Abcam公司)、免抗人PD-L1單克隆抗體(英國Abcam公司)、抗原修復(fù)液(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.2.3檢測方法 采用SP免疫組織化學(xué)染色法檢測CD8+、FOXP3+及PD-L1，石蠟包埋組織4 μm厚連續(xù)切片，臨用前常規(guī)63 ℃烤爐烤1 h，二甲苯、乙醇以及80%～90%酒精浸泡，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。微波枸櫞酸鹽抗原修復(fù)，降至室溫水洗后PBS洗3次，5 min/次，滴加阻斷劑，置于室溫下15 min。加一抗(工作濃度1∶600)4 ℃孵育24 h，PBS洗3次，1 min/次；滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育30 min，PBS洗3次，3 min/次，滴加S-P試劑并37 ℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、干燥、中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.4陽性標(biāo)準(zhǔn)[8]PD-L1陽性主要定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，以棕黃色、棕褐色為表達(dá)陽性，根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞率進(jìn)行半定量分析，每張免疫組化切片隨機(jī)選擇5個(gè)具有代表性的高倍視野(×400)進(jìn)行評估，無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；陽性細(xì)胞率≤5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分。上述兩項(xiàng)積分相加，0～2分為陰性，≥3分為陽性。

CD8陽性主要定位于細(xì)胞膜，F(xiàn)OXP3陽性主要定位于細(xì)胞核，以棕黃色、棕褐色為表達(dá)陽性，隨機(jī)選取間質(zhì)、癌巢中5個(gè)具有代表性的高倍視野(×400)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，求取CD8+/FOXP3+比值，以中位數(shù)為界限，高于中位數(shù)為高比值，低于中位數(shù)為低比值。

1.2.5隨訪 術(shù)后采用電話隨訪或門診隨訪的形式進(jìn)行為期2年的隨訪，每個(gè)月隨訪一次，以隨訪終點(diǎn)或患者死亡為隨訪截止時(shí)間，分析所有患者的生存情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用t檢驗(yàn)，若不符合則采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析；影響因素分析采用Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD8+、FOXP3及PD-L1表達(dá)情況CD8陽性主要定位于細(xì)胞膜，F(xiàn)OXP3陽性主要定位于細(xì)胞核，PD-L1陽性主要定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，以棕黃色、棕褐色為表達(dá)陽性，100例患者中，58例PD-L1表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率58.00%(58/100)；54例CD8+/FOXP3+為高比值，占54.000%(54/100)。

2.2 PD-L1陽性組與陰性組臨床特征比較兩組性別、年齡、TNM分期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，陽性組腫瘤直徑大于陰性組(P<0.05)，見表1。

表1 PD-L1陽性組與陰性組臨床特征比較

2.3 CD8+/FOXP3+高比值與低比值組臨床特征比較兩組性別、年齡、TNM分期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高比值組腫瘤直徑小于低比值組(P<0.05)，見表2。

表2 CD8+/FOXP3+高比值與低比值組臨床特征比較

2.4 食管鱗癌組織PD-L1表達(dá)與CD8+、FOXP3+的關(guān)系PD-L1表達(dá)與CD8+呈正相關(guān)，與FOXP3呈負(fù)相關(guān)及CD8+/FOXP3+呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 食管鱗癌組織PD-L1表達(dá)與CD8+、FOXP3+的關(guān)系

2.5 隨訪情況截至隨訪終點(diǎn)，100例食管鱗癌患者全部完成隨訪，平均隨訪(22.14±3.08)月，死亡15例，存活85例。患者2年存活率85.00%(85/100)。

2.6 食管鱗癌預(yù)后的影響因素分析腫瘤長度、術(shù)后感染、PD-L1表達(dá)、CD8+/FOXP3+比值是食管鱗癌預(yù)后的影響因素，見表4。

表4 食管鱗癌預(yù)后的影響因素分析

3 討論

目前臨床主要采用以手術(shù)方式治療食管鱗癌，雖然近期療效顯著，但遠(yuǎn)期預(yù)后并不十分理想，局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是失敗的主要原因[8]。雖然眾多研究學(xué)者對食管鱗癌的治療做出諸多嘗試與努力，但患者的預(yù)后并未得到明顯改善，尋求新的生物標(biāo)記物預(yù)測食管鱗癌患者預(yù)后，并未治療提供指導(dǎo)一直以來是臨床研究熱點(diǎn)。

隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究逐步深入，臨床認(rèn)為免疫逃逸在腫瘤持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮重要作用，腫瘤細(xì)胞表面缺少能夠被T細(xì)胞識別的特異性抗原、抗原提呈相關(guān)基因突變引發(fā)抗原提呈功能受損、抑制蛋白抑制T細(xì)胞功能等均是腫瘤免疫逃逸的主要發(fā)生機(jī)制[9]，而在眾多腫瘤免疫反應(yīng)通路中，PD-L1介導(dǎo)的信號通路是其中最主要的通路之一，PD-L1與PD-1結(jié)合后能夠抑制腫瘤壞死因子、白介素因子等細(xì)胞因子，從而抑制T細(xì)胞的功能；同時(shí)，腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平的上調(diào)，腫瘤環(huán)境中的PD-L1與PD-1相互作用會導(dǎo)致腫瘤特異性T細(xì)胞功能受到抑制[10]。既往諸多研究顯示，PD-L1表達(dá)與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)，且PD-L1表達(dá)水平是獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測因素，PD-L1表達(dá)陰性患者的預(yù)后明顯優(yōu)于PD-L1表達(dá)陽性患者[11]，由此可猜測，在食管鱗癌中，PD-L1介導(dǎo)的信號通路在腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的發(fā)展中扮演重要角色。

腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤被認(rèn)為是機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的體現(xiàn)，腫瘤浸潤性細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均具有重要作用，并且能夠預(yù)測多種腫瘤的預(yù)后。食管癌組織內(nèi)浸潤細(xì)胞CD8+與干擾素-γ密切相關(guān)，腫瘤組織中CD8+浸潤T細(xì)胞越多，患者預(yù)后越佳。然后相關(guān)研究表明[12]，F(xiàn)OXP3+的表達(dá)決定著Treg 細(xì)胞的產(chǎn)生，F(xiàn)OXP3能夠參與Treg 細(xì)胞的激活與功能調(diào)節(jié)，亦是其發(fā)揮免疫功能的重要因素，而Treg 細(xì)胞能夠抑制CD8+浸潤T細(xì)胞的增殖，破壞T淋巴細(xì)胞亞群之間的平衡，抑制機(jī)體免疫功能[13]，由此可見，CD8+、FOXP3+在某種程度上均與免疫逃逸具有一定關(guān)系，因此兩者的比值與食管癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后存在聯(lián)系。

本研究結(jié)果顯示，PD-L1陽性主要定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，以棕黃色、棕褐色為表達(dá)陽性，且PD-L1陽性組的腫瘤直徑顯著大于陰性組，說明PD-L1表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展具有一定關(guān)系，食管鱗癌患者的腫瘤直徑越大，其PD-L1表達(dá)陽性率越高，PD-L1與PD-1共同介導(dǎo)的信號通路在免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，通過抑制相關(guān)細(xì)胞因子、PD-L1與PD-1相互結(jié)合等作用機(jī)制使得特異性T細(xì)胞免疫功能受到抑制，腫瘤惡性增殖發(fā)展，因此其病變腫瘤直徑更大。同時(shí)，本研究還表明，CD8陽性主要定位于細(xì)胞膜，F(xiàn)OXP3陽性主要定位于細(xì)胞核，CD8+/FOXP3+高比值組的腫瘤直徑顯著小于低比值組，F(xiàn)OXP3+的表達(dá)決定著Treg 細(xì)胞的產(chǎn)生，而Treg 細(xì)胞能夠抑制CD8+浸潤T細(xì)胞的增殖，破壞T淋巴細(xì)胞亞群之間的平衡，抑制機(jī)體免疫功能，且細(xì)胞CD8+與干擾素-γ密切相關(guān)，腫瘤組織中CD8+浸潤T細(xì)胞越多，患者預(yù)后越佳，由此可見，CD8+/FOXP3+比值越低，腫瘤患者免疫功能抑制越嚴(yán)重，腫瘤惡性增殖發(fā)展。而通過Pearson相關(guān)性分析顯示，PD-L1表達(dá)與CD8+呈顯著正相關(guān)，與FOXP3呈顯著負(fù)相關(guān)，與CD8+/FOXP3+呈顯著負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步佐證上述變化趨勢，PD-L1越高，CD8+/FOXP3+比值越低，食管鱗癌患者腫瘤更加惡性發(fā)展增殖，患者預(yù)后越差。通過食管鱗癌預(yù)后的多因素Logistic回歸分析，腫瘤長度、術(shù)后感染、PD-L1表達(dá)、CD8+/FOXP3+比值均是食管鱗癌患者預(yù)后的重要預(yù)測因素，提示食管鱗癌組織中PD-L1表達(dá)、CD8+/FOXP3+均會通過影響T細(xì)胞免疫功能，導(dǎo)致腫瘤惡性發(fā)展增殖，從而影響患者預(yù)后。

綜上所述，食管鱗癌患者存在PD-L1高表達(dá)，PD-L1、CD8+/FOXP3+可參與免疫逃逸，抑制T細(xì)胞免疫功能，導(dǎo)致腫瘤增殖發(fā)展，其表達(dá)水平與腫瘤大小具有一定關(guān)系，可作為監(jiān)測食管鱗癌病情發(fā)展及預(yù)后的重要預(yù)測因子。