王鄧超，王 勇，余 淼，楊玉輝，雷躍華，李 曦，魏 健，張 陳

(1.四川省自貢市第四人民醫(yī)院 a.普通外一科，b.病理科，四川 自貢 643000；2.四川省衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)教研室，四川 自貢 643000)

胃腸間質(zhì)瘤(GIST)的起病機(jī)制是和基因發(fā)生的突變密切有關(guān)[1]。肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(Pin1)目前被公認(rèn)是在多種腫瘤發(fā)生中的具有催化作用的因子，它不僅可以通過多種途徑誘導(dǎo)正常細(xì)胞發(fā)生增殖，還能夠阻止正常細(xì)胞的凋亡進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生[2]。細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)是對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控起著重要的調(diào)控作用，過度表達(dá)的細(xì)胞周期蛋白D1會(huì)使原本正常生長(zhǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)持續(xù)增殖的狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性[3]。Pin1與CyclinD1二者之間產(chǎn)生相互作用而共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞的周期[4]。本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)55例胃腸間質(zhì)瘤組織及其瘤旁正常組織中Pin1和CyclinD1的表達(dá)情況，探討Pin1、CyclinD1在胃腸間質(zhì)瘤發(fā)生中的作用機(jī)制以及二者與臨床病理特征方面的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料2014～2019年在我科通過手術(shù)切除的胃腸間質(zhì)瘤的腫瘤組織及瘤旁正常組織共計(jì)55例，瘤旁組織定義為同一患者與間質(zhì)瘤腫瘤組織邊緣的距離大于0.5 cm的組織，術(shù)后病檢證實(shí)該組織中無腫瘤細(xì)胞的存在。所有納入的研究對(duì)象屬于原發(fā)性胃腸間質(zhì)瘤；患者手術(shù)之前均沒有口服伊馬替尼等藥物進(jìn)行輔助治療；經(jīng)胸腹CT或者磁共振排除合并其他系統(tǒng)的惡性腫瘤。其中男28例，女27例；年齡>50歲31例，<50歲24例；極低危險(xiǎn)度3例，低危險(xiǎn)度10例，中危險(xiǎn)度18例，高危險(xiǎn)度24例。

1.2 方法①組織標(biāo)本經(jīng)10%的福爾馬林溶液固定24小時(shí)后進(jìn)行解剖、脫水、石蠟包埋、切片。②采取SP法(鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色。通過切片加熱、脫蠟、抗原修復(fù)、加入抗體、蘇木紫復(fù)染、透明、固定、室溫下晾干、封片等步驟完成。

1.3 結(jié)果判斷所有組織的染色切片均由我院病理科兩位富有閱片經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師在同一條件下用光學(xué)顯微鏡采用雙盲法的方式進(jìn)行染色圖片閱片。參考NakashimaCritical標(biāo)準(zhǔn)[5]，Pin1結(jié)果的判定由染色強(qiáng)度分值及染色陽性細(xì)胞數(shù)分值的乘積決定：染色強(qiáng)度分值： 沒有染色者計(jì)為0分，出現(xiàn)淡黃色的染色顆粒計(jì)為1分，出現(xiàn)較多的棕黃色染色顆粒計(jì)為2分，出現(xiàn)大量棕黃色染色顆粒計(jì)為3分；陽性細(xì)胞數(shù)分值： 陽性細(xì)胞出現(xiàn)率低于1%者設(shè)為0分，陽性細(xì)胞出現(xiàn)率1%～33%者設(shè)為1分，陽性細(xì)胞出現(xiàn)率34%～66%者設(shè)為2分，陽性細(xì)胞出現(xiàn)率≥67%者設(shè)為3分；如果染色強(qiáng)度分值和陽性細(xì)胞數(shù)分值之乘積低于3分時(shí)將結(jié)果判定為陰性(-)；當(dāng)二者的乘積大于3分時(shí)將結(jié)果判定為陽性(+)。CyclinD1結(jié)果判定：當(dāng)組織的細(xì)胞核和(或)胞漿呈現(xiàn)出紅色的染色顆粒將CyclinD1的結(jié)果定為陽性細(xì)胞，如果陽性細(xì)胞數(shù)低于10%將結(jié)果判定為陰性(-)，陽性細(xì)胞率高于10%將結(jié)果判定為陽性(+)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法；計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Pin1蛋白與CyclinD1蛋白在胃腸間質(zhì)瘤腫瘤組織中的陽性表達(dá)率74.5%(41/55)，而在間質(zhì)瘤的瘤旁組織的表達(dá)陽性率卻為0%，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=65.36，P<0.05)。Pin1蛋白的陽性表達(dá)狀態(tài)在GIST的不同危險(xiǎn)度分級(jí)中表達(dá)存在差異(P<0.05)，在GIST患者不同性別、年齡、間質(zhì)瘤的核分裂象水平、間質(zhì)瘤瘤體的直徑、腫瘤所位于的位置、間質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、腫瘤是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組間無差異(P> 0.05)。CyclinD1蛋白在胃腸間質(zhì)瘤腫瘤組織的表達(dá)陽性率58.2%(32/55)，而在間質(zhì)瘤的瘤旁組織表達(dá)陽性率為0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=45.13，P<0.05)。CyclinD1的陽性表達(dá)狀態(tài)在不同GIST的危險(xiǎn)度分級(jí)中表達(dá)存在差異(P<0.05)，在GIST患者不同性別、年齡、間質(zhì)瘤的核分裂象水平、間質(zhì)瘤瘤體的直徑、腫瘤所位于的位置、間質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、腫瘤是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組間無差異(P> 0.05)。見表1。Pin1與CyclinD1蛋白在55例GIST瘤體組織中均呈現(xiàn)陽性表達(dá)的例數(shù)為29例，均呈現(xiàn)陰性表達(dá)的例數(shù)為11例。

表1 Pin1及CyclinD1在胃腸間質(zhì)瘤組織中的表達(dá)陽性率及與臨床病理特征的關(guān)系 [n(%)]

3 討論

GIST是一種由間葉組織來源的腫瘤[6]，大部分該腫瘤可以表達(dá)CD117和DOG1，且大多數(shù)該腫瘤存在著C-KIT(和)或PDGFRA的活化突變[7]。即使是GIST的原發(fā)病灶通過靶向藥物治療聯(lián)合規(guī)范化的手術(shù)切除后其復(fù)發(fā)率也仍較高[8]。因此在GIST的發(fā)病病因、診斷以及治療上迫切需要尋找新的可行途徑。細(xì)胞周期的調(diào)控與腫瘤的發(fā)生有著緊密聯(lián)系，其中肽基脯氨酞順反異構(gòu)酶(Pin1)以及細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)在正常細(xì)胞出現(xiàn)癌變的發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的影響，目前已經(jīng)在人類的多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)兩種蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出過度表達(dá)狀態(tài)[9]。Pin1與腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用引起了醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。Pin1的表達(dá)水平狀態(tài)與細(xì)胞分裂緊密聯(lián)系，在正常細(xì)胞中Pin1活性狀態(tài)一般很低，然而它在分裂旺盛的細(xì)胞中(如大多數(shù)腫瘤細(xì)胞)卻較容易被檢測(cè)到；在高度分化的細(xì)胞中Pin1呈現(xiàn)出低表達(dá)狀態(tài)或幾乎難以檢測(cè)到它的存在，目前研究發(fā)現(xiàn)Pin1的調(diào)控紊亂將引起人類多種疾病的發(fā)生，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中它的作用尤為突出[10]，通過本研究中可以看出，Pin1蛋白在瘤旁組織中呈不表達(dá)狀態(tài)或僅僅只是在核中呈很微弱的表達(dá)，而它在本研究中的間質(zhì)瘤瘤體組織中則呈現(xiàn)出過表達(dá)的狀態(tài)。Pin1可以通過多種有絲分裂蛋白對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響，因此它能夠參與到細(xì)胞的周期調(diào)控中而發(fā)揮作用。在早期的有關(guān)細(xì)胞周期研究中發(fā)現(xiàn)，通過外界作用去除Pin1的細(xì)胞將會(huì)停滯于有絲分裂期，然而如果細(xì)胞中的Pin1出現(xiàn)過度表達(dá)狀態(tài)卻會(huì)導(dǎo)致本來正常生長(zhǎng)的細(xì)胞停滯于G2期[11]。研究表明，Pin1如果在細(xì)胞中呈現(xiàn)過度表達(dá)的狀態(tài)會(huì)引起正常乳腺上皮細(xì)胞朝著惡性方向轉(zhuǎn)化，同時(shí)已經(jīng)被誘導(dǎo)的惡性表型也會(huì)加強(qiáng)，然而敲除細(xì)胞的Pin1之后，這種由誘導(dǎo)而呈現(xiàn)出的惡性表型則會(huì)出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，最后將引起癌細(xì)胞的調(diào)亡[12]。大量分子生物學(xué)研究以及Pin1抑制劑的研究表明，Pin1在未來抗癌藥物的研制中有望成為一個(gè)新的理想的靶標(biāo)。

CyclinD1作為細(xì)胞周期蛋白的與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤的預(yù)后都有著緊密的聯(lián)系。在近年研究中發(fā)現(xiàn)，CyclinD1在膀胱惡性腫瘤、乳腺惡性腫瘤、甲狀旁腺腫瘤、淋巴瘤、肺惡性腫瘤等惡性腫瘤中的基因過表達(dá)以及基因擴(kuò)增都密切相關(guān)。已經(jīng)證實(shí)CyclinD1是細(xì)胞周期成分中與腫瘤的發(fā)生有最直接聯(lián)系的癌基因，它的致癌機(jī)制是通過作用于G1期的多種蛋白，與這些蛋白產(chǎn)生相互影響，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期，這樣就加快了細(xì)胞周期的速度，最終導(dǎo)致正常生長(zhǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生惡性變。G1期的CyclinD1表達(dá)在正常情況下是恒定的，然而在基因擴(kuò)增、易位的情況下就會(huì)引起CyclinD1呈現(xiàn)出過表達(dá)的狀態(tài)，這將會(huì)使得細(xì)胞周期縮短，進(jìn)而異常細(xì)胞增殖紊亂及不斷堆積，最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變發(fā)生[13]。研究表明，CyclinD1除了作為原癌基因的身份以外還是重要靶基因之一，pin1可以通過兩種途徑調(diào)控CyclinD1的表達(dá)，一是在轉(zhuǎn)錄水平上引起CyclinD1轉(zhuǎn)錄；二是通過誘導(dǎo)CyclinD1發(fā)生構(gòu)型改變，進(jìn)而防止CyclinD1從細(xì)胞核往細(xì)胞漿中遷移發(fā)生降解，引起CyclinD1呈現(xiàn)過表達(dá)的狀態(tài)，最終細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化和增殖[14]。

本研究的相關(guān)結(jié)果表明，Pin1與CyclinD1在間質(zhì)瘤組織的的陽性表達(dá)情況在不同危險(xiǎn)度組間表達(dá)存在差異。但我們?cè)谠撗芯康慕y(tǒng)計(jì)中發(fā)現(xiàn)CyclinD1的陽性表達(dá)在不同間質(zhì)瘤的瘤體直徑組間表達(dá)無差異，與國(guó)內(nèi)黃子成等[15]的研究不相一致，提示不同類型的腫瘤細(xì)胞表達(dá)情況不盡相同，也可能與我們的胃腸間質(zhì)瘤標(biāo)本量小有關(guān)，也提示了在不同細(xì)胞類型的腫瘤中，可能通過不同的機(jī)制對(duì)不同細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生不盡相同的影響。GIST組織中Pin1、CyclinD1呈現(xiàn)過表達(dá)的狀態(tài)，且二者的表達(dá)水平高低與GIST的危險(xiǎn)度有關(guān)，這樣就表明GIST的發(fā)病病因與Pin1和 CyclinD1二者在間質(zhì)瘤組織中表達(dá)過度所引起的正常細(xì)胞出現(xiàn)增殖異常有關(guān)，二者在GIST的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著相互促進(jìn)、協(xié)同的影響，影響著GIST 的發(fā)生以及演變，甚至間質(zhì)瘤的預(yù)后，希望該理論依據(jù)能夠可以為胃腸間質(zhì)瘤的今后臨床上新的治療提供方向。但是本研究納入的間質(zhì)瘤例數(shù)較少，未能對(duì)不同基因突變類型、分子靶向治療前后情況以及隨訪不同的預(yù)后進(jìn)行對(duì)比和探討，還需要更多的資料及多中心進(jìn)一步的研究和分析，將有助于進(jìn)一步闡明Pin1和CyclinD1在胃腸間質(zhì)瘤中發(fā)生、發(fā)展的作用及其臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系。