唐源淋 陳 燁

深圳市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科1(518114) 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科 廣東省胃腸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2

背景：肝硬化發(fā)病率在我國(guó)逐年上升，尤其是失代償期肝硬化及其相關(guān)并發(fā)癥嚴(yán)重威脅國(guó)人健康。目的：研究肝硬化患者的腸道菌群改變及其與病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系。方法：納入2010年12月—2011年7月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院收治的肝硬化患者100例和50名健康人，提取糞便標(biāo)本基因組DNA，采用菌屬特異性引物行real-time PCR定量檢測(cè)，分析腸道菌群改變與肝功能分級(jí)、預(yù)后評(píng)分、炎癥指標(biāo)以及肝硬化并發(fā)癥的相關(guān)性。結(jié)果：與對(duì)照組相比，肝硬化組糞便中腸桿菌屬數(shù)量顯著增加，乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬數(shù)量顯著減少(P均<0.05)。腸桿菌屬數(shù)量與肝功能分級(jí)、Child-Turcotte-Pugh(CTP)評(píng)分、終末期肝病模型(MELD)評(píng)分、C反應(yīng)蛋白(CRP)和自發(fā)性腹膜炎呈顯著正相關(guān)(P均<0.05)，梭菌屬則與上述指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論：在肝硬化患者中，腸道菌群失衡(腸桿菌屬數(shù)量增加、梭菌屬數(shù)量減少)與病情嚴(yán)重程度和預(yù)后有一定相關(guān)性。菌群失衡可能通過(guò)促進(jìn)炎癥反應(yīng)參與肝硬化進(jìn)展。

肝硬化是我國(guó)常見(jiàn)病，發(fā)病率逐年上升，尤其是失代償期肝硬化及其相關(guān)并發(fā)癥嚴(yán)重威脅國(guó)人健康。失代償期肝硬化患者常死于感染、上消化道出血、肝性腦病等并發(fā)癥。在人體與微生物的交互作用中，腸-肝軸居關(guān)鍵地位[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，腸道菌群失衡在大鼠肝硬化模型并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[2-3]。目前關(guān)于肝硬化患者腸道菌群的臨床研究較少，對(duì)發(fā)生紊亂的菌群及其對(duì)患者預(yù)后的影響尚不明確。本研究以健康人作為對(duì)照，分析肝硬化患者的腸道菌群改變及其與病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系。

材料與方法

一、研究對(duì)象

研究納入2010年12月—2011年7月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科和感染內(nèi)科收治的肝硬化患者100例，入選者均為肝炎后肝硬化，男性88例，女性12例，平均年齡(52±13)歲；肝功能Child-Pugh分級(jí)A級(jí)50例，B級(jí)31例，C級(jí)19例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床表現(xiàn)、組織形態(tài)學(xué)和影像學(xué)檢查確診，符合肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)；②病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心、腦、肺、腎等器官功能不全(不包括肝腎綜合征、肝肺綜合征、肝性腦病)；②合并功能性消化不良、慢性腹瀉、炎癥性腸病等已知可引起腸道菌群紊亂的胃腸道疾??；③有胃腸道手術(shù)史。50例對(duì)照者為同期南方醫(yī)院體檢中心經(jīng)常規(guī)檢查無(wú)異常發(fā)現(xiàn)的健康成人，男性36例，女性14例，平均年齡(53±12)歲。兩組間性別構(gòu)成、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、方法

1. 標(biāo)本采集：標(biāo)本采集前4周內(nèi)所有受檢者均未使用抗菌藥物和微生態(tài)制劑。于排便后2 h內(nèi)將糞便標(biāo)本收集于密閉的糞便儲(chǔ)存盒內(nèi)。外周血標(biāo)本5 mL收集于促凝采血管中，平衡后室溫離心3 500 r/min×5 min，血清分離后分裝。上述標(biāo)本迅速儲(chǔ)存于-80 ℃低溫冰箱中。

2. 糞便基因組DNA提?。菏褂肨IANamp糞便DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]。每例受檢者稱(chēng)取20 mg糞便樣本，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，-20 ℃保存。

3. PCR引物設(shè)計(jì)：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)腸桿菌屬、腸球菌屬、乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬的菌屬特異性引物[4-5]，使用BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì)引物序列特異性(表1)。

4. PCR引物特異性檢測(cè)：提取健康成人糞便基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(溫度見(jiàn)表1)，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析未見(jiàn)明顯非特異性擴(kuò)增，提示各菌屬引物特異性良好。

表1 菌屬特異性PCR引物

5. Real-time PCR：使用天根生化科技(北京)有限公司的real-time PCR試劑盒。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)10倍稀釋?zhuān)@得10～107系列拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品，以之為模板構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 3 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，退火20 s(腸桿菌屬58 ℃，腸球菌屬52 ℃，乳酸桿菌屬58 ℃，擬桿菌屬60 ℃，梭菌屬60 ℃)，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析熔解曲線。將待測(cè)糞便DNA適當(dāng)稀釋?zhuān)磻?yīng)體系和反應(yīng)條件同上，行real-time PCR擴(kuò)增。檢測(cè)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以M(P25,P75)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組間比較采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)中的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)；率的比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、肝硬化患者腸道菌群改變

與對(duì)照組相比，肝硬化組糞便中腸桿菌屬數(shù)量增加，乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬數(shù)量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，腸球菌屬數(shù)量無(wú)明顯變化(P>0.05；表2)。將腸桿菌屬、腸球菌屬數(shù)量高于對(duì)照組中位值和乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬數(shù)量低于對(duì)照組中位值定義為腸道菌群異常，肝硬化組腸桿菌屬、腸球菌屬、乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬正常與異常者的比例分別為28/72、60/40、33/67、25/75和27/73，其中腸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬異常者占比高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006;P=0.007;P=0.003)。

表2 肝硬化組與對(duì)照組腸道菌群比較[M(P25, P75), lg copies/g濕糞]

二、腸道菌群與肝硬化嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系

除乳酸桿菌屬外，其余四種菌屬在不同肝功能分級(jí)肝硬化患者中的數(shù)量分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；表3)。相關(guān)性分析顯示，腸桿菌屬數(shù)量與Child-Pugh分級(jí)、Child-Turcotte-Pugh(CTP)評(píng)分、終末期肝病模型(MELD)評(píng)分和血清C反應(yīng)蛋白(CRP)水平呈顯著正相關(guān)(P=0.022;P=0.044;P=0.043;P=0.021)；腸球菌屬與前三個(gè)指標(biāo)呈顯著正相關(guān)(P=0.012;P=0.005;P=0.017)；梭菌屬與四個(gè)指標(biāo)均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001;P<0.001;P=0.007;P=0.003)；擬桿菌屬只與Child-Pugh分級(jí)呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.011)；乳酸桿菌屬與四個(gè)指標(biāo)均無(wú)相關(guān)性(P>0.05；表4)。

表3 不同肝功能分級(jí)肝硬化患者腸道菌群比較[M(P25, P75), lg copies/g濕糞]

表4 腸道菌群與肝硬化嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系(秩相關(guān)系數(shù)rs)

三、腸道菌群與肝硬化并發(fā)癥的關(guān)系

相關(guān)性分析顯示，肝硬化并發(fā)癥與腸道菌群失衡之間有一定關(guān)聯(lián)，腸桿菌屬、腸球菌屬數(shù)量與自發(fā)性腹膜炎的發(fā)生呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，梭菌屬數(shù)量則與之呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；腸球菌屬數(shù)量與腹水發(fā)生呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；乳酸桿菌屬、擬桿菌屬數(shù)量與肝硬化并發(fā)癥無(wú)相關(guān)性(P>0.05；表5)。

表5 腸道菌群與肝硬化并發(fā)癥的關(guān)系

討 論

人體腸道內(nèi)有近1014個(gè)微生物，分屬于500～1 000個(gè)不同種類(lèi)[6]，包括細(xì)菌、真菌、病毒等。腸道細(xì)菌包括需氧菌、兼性厭氧菌和厭氧菌，以厭氧菌為主，主要有擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、疣微菌門(mén)等，前兩種菌門(mén)占腸道細(xì)菌總量的70%以上，是腸道微生物的重要組成部分。在腸道微生物與宿主相互適應(yīng)的過(guò)程中，微生物、宿主與腸道微環(huán)境之間達(dá)到一種平衡，此種平衡狀態(tài)對(duì)人體生理活動(dòng)和健康發(fā)揮至關(guān)重要的作用。腸道內(nèi)、外環(huán)境的改變導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)菌群減少，進(jìn)而引起腸道菌群失衡/紊亂，過(guò)路菌或條件致病菌數(shù)量超出正常水平致疾病發(fā)生。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)肥胖[7]、炎癥性腸病[8]、腸易激綜合征[9]、2型糖尿病[10]、代謝綜合征[11]、非酒精性脂肪性肝病[3,12]等多種疾病與腸道菌群失衡有關(guān)，且不斷有證據(jù)表明腸道菌群在肝硬化及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[3]。

本研究應(yīng)用real-time PCR技術(shù)定量檢測(cè)肝硬化患者的糞便菌群改變，結(jié)果提示患者存在不同程度的腸道菌群失衡，表現(xiàn)為腸桿菌屬數(shù)量顯著增加，乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬數(shù)量顯著減少，腸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬菌群異常者占比顯著增高。腸桿菌屬數(shù)量隨肝功能的惡化而逐步增加，并與提示預(yù)后的MELD評(píng)分、炎癥指標(biāo)CRP以及肝硬化并發(fā)癥自發(fā)性腹膜炎的發(fā)生呈顯著正相關(guān)；擬桿菌屬、梭菌屬數(shù)量則隨肝功能的惡化而減少，其中梭菌屬與MELD評(píng)分、CRP和自發(fā)性腹膜炎呈顯著負(fù)相關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)提示肝硬化患者的腸道菌群失衡，尤其是腸桿菌屬、擬桿菌屬和梭菌屬的變化與肝硬化病情和預(yù)后之間有密切聯(lián)系，臨床上應(yīng)予充分重視。國(guó)、內(nèi)外其他關(guān)于腸道菌群與肝硬化的研究亦得出與本研究大致或部分相符的結(jié)果[13-16]，如鐘轉(zhuǎn)華[15]的研究發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的腸道菌群失衡表現(xiàn)為雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益厭氧菌減少，腸桿菌、葡萄球菌、梭菌增加，且上述菌群變化可隨肝功能好轉(zhuǎn)而恢復(fù)；Chen等[14]和Kakiyama等[16]也報(bào)道了肝硬化患者腸道中條件致病菌腸桿菌顯著增加。Lata等[17]的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中，肝硬化患者的基線腸道菌群失衡嚴(yán)重程度與肝硬化病因無(wú)關(guān), 而與肝功能分級(jí)相關(guān)。這些研究結(jié)果均表明腸道菌群失衡與肝硬化患者的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后有密切聯(lián)系，可加速疾病進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)肝硬化患者腸道梭菌屬數(shù)量顯著減少，且與病情和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。Qin等[13]的宏基因組學(xué)研究也證實(shí)了這一變化，但亦有肝硬化患者腸道梭菌數(shù)量增加的報(bào)道[15]。梭菌屬是腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)厭氧菌，包含梭桿菌、梭球菌、艱難梭菌等眾多細(xì)菌。其中艱難梭菌是一種可致偽膜性腸炎的致病菌，梭桿菌則可酵解結(jié)腸中不消化的碳水化合物，產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)[18]。SCFAs不僅能為結(jié)腸細(xì)胞供能，而且對(duì)維持腸道細(xì)胞的完整性以及分泌和免疫功能具有重要意義，可加強(qiáng)腸黏膜屏障功能。本研究結(jié)果提示腸道梭菌屬對(duì)肝硬化患者有一定保護(hù)作用，梭菌屬中可能存在一些有益菌種，但尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

目前研究認(rèn)為腸道微環(huán)境改變是肝硬化患者發(fā)生腸道菌群失衡的機(jī)制之一。肝硬化時(shí)腸道黏膜充血水腫，營(yíng)養(yǎng)狀況差，菌群營(yíng)養(yǎng)底物缺乏；次級(jí)膽汁酸和分泌型IgA(sIgA)減少，膽汁中含有可抑制腸道細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)的多種抗體和非特異性抗黏附素成分，并能中和細(xì)菌內(nèi)毒素，因此肝硬化時(shí)腸腔內(nèi)膽汁減少不利于腸道菌群的平衡[16]；腸蠕動(dòng)減慢，清除能力降低，導(dǎo)致腸道細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)[19]。上述因素使維持腸道微生態(tài)平衡的宿主因素受到破壞，最終導(dǎo)致菌群失衡。腸道菌群失衡后，革蘭陰性桿菌產(chǎn)生大量?jī)?nèi)毒素，通過(guò)損傷的腸屏障進(jìn)入體循環(huán)，形成內(nèi)毒素血癥，激活肝臟Kupffer細(xì)胞，釋放大量促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-6、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，使肝損害持續(xù)，進(jìn)一步惡化肝功能，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[20]。CRP是反映機(jī)體炎癥狀態(tài)的重要指標(biāo)，本研究分析顯示肝硬化患者的腸桿菌屬和梭菌屬數(shù)量與血清CRP水平顯著相關(guān)，進(jìn)一步提示了菌群失衡可能通過(guò)促進(jìn)炎癥反應(yīng)在肝硬化進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮作用。

綜上所述，腸道菌群失衡在肝硬化及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，與病情嚴(yán)重程度和預(yù)后有一定相關(guān)性?；颊叱霈F(xiàn)腸道菌群紊亂、腸黏膜通透性增加，提示肝損傷嚴(yán)重，預(yù)后可能較差。因此，在臨床工作中，檢測(cè)肝硬化患者的腸道菌群和腸黏膜通透性對(duì)病情評(píng)估和改善預(yù)后具有重要意義。尤其值得關(guān)注的腸道菌群包括腸桿菌屬、擬桿菌屬和梭菌屬，對(duì)上述菌群進(jìn)行更深入的研究，可能為研發(fā)新的益生菌制劑提供理論依據(jù)。微生態(tài)制劑干預(yù)是阻斷肝硬化腸道菌群失衡的關(guān)鍵，但相關(guān)制劑種類(lèi)繁多，目前研究未能提供充分的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持何種益生菌制劑更有效及其臨床使用的適宜周期，需擴(kuò)大樣本量、延長(zhǎng)隨訪時(shí)間作進(jìn)一步研究。不同種類(lèi)的微生態(tài)制劑作用機(jī)制不同，不同病因肝硬化治療過(guò)程中益生菌的選擇亦不確定，因此微生態(tài)制劑菌種的篩選亟待加強(qiáng)。這一工作需要更細(xì)致的菌群分析結(jié)果，這也對(duì)肝硬化患者腸道菌群的定量分析提出了更高的要求，是未來(lái)腸道微生態(tài)研究的重要方向之一。