張 丹 李茜瑩 楊延婷 趙 越 吳麗潔 智方圓 施 征 馬曉芃,#

上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所1(200030) 上海中醫(yī)藥大學(xué)2

泛素化是重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，涉及的酶類主要為E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶、E3泛素連接酶(下文簡稱E3)，主要效應(yīng)包括蛋白質(zhì)的降解和功能調(diào)節(jié)。泛素化修飾與神經(jīng)退行性變、免疫、炎癥、腫瘤等均密切相關(guān)，是探索疾病發(fā)生機制和治療的研究熱點[1]。

一、泛素化修飾與炎癥性腸病(IBD)

泛素化修飾先由E1泛素激活酶活化單個游離泛素，再將活化的泛素傳遞至E2泛素結(jié)合酶，由E3招募特異性底物蛋白和E2泛素結(jié)合酶，介導(dǎo)泛素從E2泛素結(jié)合酶轉(zhuǎn)移至底物蛋白，最終泛素化的底物蛋白由26S蛋白酶體降解，或改變細(xì)胞內(nèi)定位、活性以及與其他蛋白相互作用，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種信號通路的級聯(lián)反應(yīng)。泛素化異常參與了IBD的發(fā)生和發(fā)展，泛素酶及其抗體有望成為克羅恩病(CD)臨床診斷和評估病情嚴(yán)重程度的重要標(biāo)志物。全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)研究[2]表明E3 RNF186罕見變異類型與IBD存在相關(guān)性。正常人黏膜巨噬細(xì)胞 (Mφ)中多種泛素蛋白酶的表達較少，腸道Mφ呈非激活、無反應(yīng)的功能表型。IBD患者黏膜Mφ為激活表型，泛素蛋白酶表達明顯上調(diào)，表現(xiàn)為抗原呈遞和炎癥反應(yīng)[3]。同時，與正常組比較，實驗性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中泛素mRNA表達明顯升高[4]。因此，泛素化異常可能是IBD結(jié)腸炎癥和免疫損傷發(fā)生的重要機制之一。

二、E3的種類和功能

E3是靶蛋白泛素化修飾的關(guān)鍵因素，與靶蛋白、泛素間具有相對特異性。根據(jù)E3的結(jié)構(gòu)和功能特點主要分為兩大類，即含 HECT結(jié)構(gòu)域的E3和包含環(huán)指結(jié)構(gòu)域的RING類E3，前者是唯一一類可與泛素形成硫酯鍵中間體的泛素連接酶，可直接催化靶蛋白泛素化，后者起到橋梁作用，募集E2泛素結(jié)合酶和靶蛋白，完成泛素從E2泛素結(jié)合酶到底物蛋白的傳遞[5-7]。此外，已發(fā)現(xiàn)含有兩個RING結(jié)構(gòu)域和RBR類 E3，功能尚待深入研究[8]。近年來，一些E3靶向藥物已進入臨床試驗階段，部分已獲美國FDA批準(zhǔn)[9]。

三、E3活化參與IBD發(fā)病的作用途徑

1. 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)信號通路：NOD蛋白屬于胞質(zhì)內(nèi)NOD樣受體(NLRs)家族，是固有免疫的胞內(nèi)受體，可識別細(xì)菌肽聚糖(peptidoglycan, PGN)。主要通過激活以下幾種依賴性信號通路：核因子-κB(NF-κB)途徑、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)途徑誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。NOD信號通路在維持結(jié)腸黏膜穩(wěn)態(tài)中起有重要作用，該基因多態(tài)性異常與CD有關(guān)[10]。NOD2信號通路中關(guān)鍵蛋白的泛素化異常與炎癥相關(guān)疾病如CD、發(fā)作性結(jié)節(jié)病、Blau綜合征有關(guān)，多個E3細(xì)胞凋亡抑制蛋白1(cIAP1)、cIAP2、X鏈鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)2、TRAF4、TRAF5、TRAF6、atrophin-1相互作用蛋白(AIP-4/Itch)、鋅指蛋白A20參與其中[11]。受體相互作用蛋白2 (RIP2)是NOD的重要適配蛋白，兩者相互作用是活化下游信號通路的關(guān)鍵，該蛋白泛素化是NOD信號通路負(fù)調(diào)控的重要機制之一。E3(TRAF6)通過自我泛素化修飾，可進一步活化NOD2信號通路的RIP2蛋白，通過NF-κB信號通路，影響CD細(xì)胞因子的釋放[12]。E3(Pellino3)有調(diào)控結(jié)腸炎癥反應(yīng)作用，呈現(xiàn)免疫保護效應(yīng)，該蛋白敲除后可導(dǎo)致實驗性腸炎加重，機制可能與其調(diào)節(jié)RIP2泛素化，影響NF-κB和MAPK信號通路活化有關(guān)[13]。胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)是細(xì)胞內(nèi)的重要銜接蛋白，CARD9多態(tài)性與人類炎癥性疾病有密切關(guān)系，可通過影響腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)前炎性因子的表達，調(diào)節(jié)固有免疫，參與結(jié)腸免疫保護效應(yīng)，該蛋白異常是IBD患病的高風(fēng)險因素之一[2,14-16]。研究顯示，采用小分子化合物選擇性抑制E3(TRIM62)-CARD9復(fù)合物形成，可調(diào)節(jié)CARD9 K27或K125多聚泛素化及其依賴性信號通路，具有一定保護效應(yīng)，可降低IBD發(fā)生的風(fēng)險[14,17]。

2. 髓樣細(xì)胞分化因子88(MyD88)信號通路：MyD88蛋白含有TIR結(jié)構(gòu)域，是多數(shù)TLR和多種包膜受體介導(dǎo)信號通路的共同重要接頭蛋白，發(fā)揮募集下游激酶和調(diào)控信號傳遞的作用。MyD88依賴性通路中，該蛋白可將IL-1受體相關(guān)激酶-4(IRAK-4)吸引至TLR，并與TRAF6發(fā)生作用，TRAF6自我泛素化修飾，激活I(lǐng)RAK1/4，最終活化NF-κB和JNK/SAPK信號通路，參與IBD結(jié)腸炎癥的發(fā)生[18]。MyD88非依賴信號通路作為TLR誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的另一個途徑，TLR活化后通過激活干擾素β Toll/IL-1R結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)和 TRAF3，導(dǎo)致NF-κB抑制蛋白激酶ε/TANK結(jié)合激酶1 (IKKε/TBK1) 募集，誘導(dǎo)IRF-3磷酸化以及干擾素β的表達，發(fā)揮抗病毒作用。TRAF3、TRAF6作為E3成員，對依賴于MyD88和依賴于TRIF(非MyD88)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要的調(diào)節(jié)作用，兩者可通過泛素修飾效應(yīng)，調(diào)控炎癥相關(guān)信號通路活化，從而起到免疫防御或緩解炎癥的作用?？乖蔬f細(xì)胞樹突細(xì)胞(DC)參與調(diào)節(jié)免疫自穩(wěn)，A20扮演E3酶或去泛素化酶，對維持免疫靜止起重要作用。研究[19]提示，A20依賴性DC可能通過MyD88依賴性(T細(xì)胞浸潤)和非依賴性(T細(xì)胞和抗原提成細(xì)胞激活)雙信號通路，參與改善IBD和IBD相關(guān)關(guān)節(jié)炎的形成。

3. NF-κB信號通路：NF-κB信號通路是目前認(rèn)為調(diào)控IBD炎癥反應(yīng)的重要信號通路之一。有研究[20]表明，由NOD2誘導(dǎo)的NF-κB必須調(diào)節(jié)蛋白(NEMO)泛素化修飾能活化IKKα/β，促進NF-κB信號通路，參與CD結(jié)腸炎性損傷。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種E3介導(dǎo)的泛素化修飾均通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路影響IBD，但作用途徑不盡相同。如miR-146b通過減少E3(siah2)表達，抑制TRAF蛋白泛素化，調(diào)節(jié)NF-κB信號通路以改善結(jié)腸炎癥[21]；E3(Itch)能影響NOD2結(jié)合RIP2，進而調(diào)控p38和JNK、NF-κB信號通路活化[22]。上述研究提示蛋白泛素化修飾多發(fā)生于模式識別受體(PRRs)下游的一些重要接頭蛋白，發(fā)揮調(diào)控信號通路活化轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵作用，而NF-κB信號通路是多條上游信號通路調(diào)節(jié)的終極靶點之一，參與炎性因子的轉(zhuǎn)錄。此外，E3(RNF20/40)能驅(qū)動組蛋白H2B單泛素化，調(diào)節(jié)NF-κB信號通路和靶基因炎性因子轉(zhuǎn)錄，是炎癥和炎癥相關(guān)癌癥的發(fā)生機制之一[23]。有研究[24]表明，E3(TRIM11)p.H414Y 變異是家族性遺傳IBD的重要影響因素，可能與其上調(diào)NF-κB信號通路中κ輕鏈增強子核因子有關(guān)。

4. NOD樣受體蛋白-3(NLRP3)炎性小體：NLRP3屬于NLRs家族，與銜接分子CARD的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)和pro-caspase-1組合成促炎蛋白復(fù)合結(jié)構(gòu)，是目前研究較為深入、機制較為清晰的炎性小體。近年來，研究發(fā)現(xiàn)NLRP3基因多態(tài)性與IBD患者結(jié)腸炎嚴(yán)重程度和進展有關(guān)[25]。NLRP3炎性小體在維持腸道穩(wěn)態(tài)和預(yù)防結(jié)腸炎方面發(fā)揮重要作用，而E3含有環(huán)指結(jié)構(gòu)域的TRIM31可促進NLRP3 K48多聚泛素化，從而促使其進入蛋白酶體降解途徑[26-27]。Bednash等[28]的研究顯示，E3(A20)不僅通過阻礙NF-κB通路活化，負(fù)調(diào)控NLRP3轉(zhuǎn)錄，同時亦能抑制IL-1β第133位賴氨酸泛素化，該位點泛素化被認(rèn)為是IL-1β成熟分泌所需，共同參與抑制NLRP3炎性小體活性。Mai等[29]的研究證實，通過促進E3(Parkin)驅(qū)動的線粒體自噬，進而抑制結(jié)腸NLRP3炎性小體激活，對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有抑制作用。由此可見，不同的E3可作用于NLRP3炎性小體的不同組分，但均對炎癥反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)調(diào)控效應(yīng)。

5. CD4+T細(xì)胞：輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)主要包括Th1、Th2、Th17細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Treg細(xì)胞)。Th細(xì)胞異常在IBD的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，其中CD與Th1和Th17細(xì)胞有關(guān)，而潰瘍性結(jié)腸炎(UC)與Th2細(xì)胞緊密關(guān)聯(lián)。E3誘導(dǎo)的T細(xì)胞無反應(yīng)性是正常人結(jié)腸黏膜免疫耐受機制之一，該功能異常是UC致病的重要步驟。在無反應(yīng)性患者CD4+T細(xì)胞中E3(Grail、Itch、c-Cbl)的表達顯著高于反應(yīng)性人群，E3(Grail)在UC緩解期患者的含量顯著高于活動期患者和健康志愿者，提示E3(Grail)在維持UC患者持續(xù)緩解中起有重要作用[30]。結(jié)腸黏膜miR-290-5p通過調(diào)節(jié)E3(Grail)參與CD的病理機制[31]。Ramon等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，Nedd4家族相互作用蛋白1(Ndfip1)作為E3(Itch)的調(diào)節(jié)蛋白，通過Itch促使JunB泛素化，抑制IL-4和IL-5的產(chǎn)生，可能是Th細(xì)胞相關(guān)性胃腸炎和IBD的發(fā)生機制之一。在體內(nèi)，E3(Asb2α)可促進Th2表型增加，參與結(jié)腸炎模型相關(guān)腫瘤的進展[33]。E3(A20)能緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，可能通過促進脾臟Treg細(xì)胞群和結(jié)腸組織FOXP3表達實現(xiàn)[34]。

6. 其他：尚有多種E3可通過其他方式調(diào)節(jié)靶蛋白泛素化修飾，與IBD致病和緩解有關(guān)。E3(RNF186)可調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來維持腸道穩(wěn)態(tài)，參與結(jié)腸炎癥反應(yīng)[35]。E3(Itch)能通過調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖、分化、遷移，促使結(jié)腸上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)[36]。miR-26b靶向調(diào)節(jié)E3(DIP1)，該蛋白下調(diào)與死亡相關(guān)蛋白酶的穩(wěn)定性和UC相關(guān)結(jié)腸腫瘤的發(fā)生有關(guān)[37]。E3(cIAP2)在UC活動期患者再生上皮細(xì)胞中表達上調(diào)，可進一步降低上皮細(xì)胞鏈接Fas結(jié)構(gòu)域，對結(jié)腸上皮再生有重要影響，可能與UC相關(guān)腫瘤的發(fā)生相關(guān)[38]。E3(Fbxw7)可促進趨化因子CX3CR1高表達的Mφ中組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2降解，上調(diào)CCl2/CCl7表達，誘導(dǎo)CX3CR1中度表達的前炎性Mφ聚集于結(jié)腸組織，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[39]。

四、展望

蛋白質(zhì)的泛素化修飾是一個較為復(fù)雜的過程，在細(xì)胞生命活動中與磷酸化修飾具有同樣重要的地位，參與調(diào)控機體各種生物學(xué)功能。不同E3作用于不同靶蛋白，同一個E3也可作用于多個靶蛋白，均可引起不同的調(diào)節(jié)效應(yīng)。泛素化修飾可誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生，但同樣有抑制炎癥反應(yīng)作用，參與固有免疫的防御或損傷，關(guān)鍵或在于E3及其相應(yīng)的靶蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。多種E3已被發(fā)現(xiàn)與結(jié)腸組織病理損傷有關(guān)，調(diào)控效應(yīng)涉及增殖、凋亡、應(yīng)激、炎癥反應(yīng)多方面，泛素化作用靶點呈現(xiàn)了多樣性、復(fù)雜性。泛素修飾系統(tǒng)的相互作用參與了IBD的損傷和修復(fù)，為靶向治療的合理選擇、采取整體治療提供了一些新思考。