譚顯東,盧上飛,胡 偉,魏 琨,羊依金

(成都信息工程大學資源環(huán)境學院,四川成都 610225)

靈芝(Ganodormalucidum)是我國著名的藥用真菌,具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗衰老、保護神經細胞、抗HIV等多種功效[1-3]。靈芝的應用源遠流長,其藥用研究已有2000多年的歷史[4],目前靈芝的人工栽培進展迅速,栽培規(guī)模逐年擴大[5],靈芝生長對光、溫、水、氣的要求較為苛刻[6],同時其生長周期太過漫長。如果采用液態(tài)發(fā)酵的方法培育靈芝,盡管可以縮短培育周期[7],但是其具有廢水排放量大、投入成本大的缺點[8],因此固態(tài)發(fā)酵方法在靈芝的人工培養(yǎng)中應用更加廣泛,它具有工藝簡單低、投資少等優(yōu)勢[9-10]。

三七(Panaxnotoginseng)是一味傳統(tǒng)中藥[11],提取總皂苷[12]后的三七渣中含有三七多糖[13]、三七黃酮[14]、淀粉、粗蛋白、三七素[15]等組分,可以作為發(fā)酵基質使用[16]。以三七渣為原料固態(tài)發(fā)酵生產靈芝,發(fā)酵培養(yǎng)物中靈芝菌絲體的質量分數可達較高水平[17],同時還可以通過靈芝的代謝作用及其代謝產物酶的催化作用對三七渣中殘留的藥用分子進行結構修飾,改善其藥性。與常規(guī)培養(yǎng)基生產的靈芝菌質相比,三七渣發(fā)酵生產的靈芝菌質中除了含有靈芝三萜、靈芝多糖等靈芝代謝產物外,還含有三七皂苷、三七多糖、三七黃酮等藥性組分[18-19]。三七渣固態(tài)發(fā)酵生產靈芝菌質既可以實現(xiàn)三七渣的資源化利用,降低靈芝生產成本,又能減少固體廢棄物的排放。

本實驗以靈芝生物量為評價指標,通過響應面分析法對三七渣固態(tài)發(fā)酵生產靈芝菌質的工藝條件進行了優(yōu)化。旨在開發(fā)一種三七渣廢物資源化的方法,為中藥廠綠色生產和相關研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

川芝6號(國品認菌2007045,川審菌2004007) 四川省農業(yè)科學院土壤肥料研究所微生物室提供;MgSO4·7H2O、NaNO3、KH2PO4、葡萄糖及其他藥劑均為分析純 由成都市科龍化工試劑廠提供;三七渣(其組成成分的質量分數為:粗淀粉33.13%,粗蛋白質12.28%,真蛋白質9.97%,還原糖1.37%[20]) 由四川省某中成藥廠提供,濕物料經烘干、粉碎、過60目篩后置于干燥器中備用。

UV-2550紫外可見分光光度計 SHIMADZU公司;LDZX-50KB高壓滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;PYX-280H-C恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱 廣東韶關科力實驗儀器有限公司;SF-130中藥分析研磨機 長沙中南制藥機械廠;VT1300L-U超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 平板培養(yǎng)基:土豆20 g,葡萄糖2.0 g,蛋白胨0.2 g,酵母粉0.3 g,磷酸二氫鉀0.1 g,硫酸鎂0.06 g,蒸餾水100 mL,瓊脂粉2.0 g,121 ℃滅菌30 min,用于菌種的擴大培養(yǎng)。

種子液培養(yǎng)基:馬鈴薯20 g,葡萄糖2.0 g,蛋白胨0.2 g,酵母粉0.3 g,磷酸二氫鉀0.1 g,硫酸鎂0.06 g,蒸餾水100 mL,pH自然,121 ℃滅菌30 min,用于種子液的制備。

三七渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:過60目篩的三七渣10.00 g,酵母浸出粉5.47%,磷酸二氫鉀0.31%,初始含水量67.71%,pH自然,121 ℃滅菌1 h,用于固態(tài)發(fā)酵。

1.2.2 菌種的擴大培養(yǎng) 將川芝6號菌種接入平板培養(yǎng)基中,于28 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d。

1.2.3 種子液的制備 用打孔器在平板培養(yǎng)基的邊緣打取0.5 cm2的靈芝菌絲塊,接入100 mL種子液培養(yǎng)基中,于150 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)6～7 d制得種子液,備用。

1.2.4 單因素實驗 分別考察發(fā)酵溫度(22、25、28、31、34 ℃)、接種量(1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%)和發(fā)酵時間(4、6、8、10、12、14、16 d)對靈芝生物量的影響。若無特別說明,發(fā)酵溫度為28 ℃,接種量為10%,發(fā)酵時間為12 d。

1.2.5 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化實驗 在單因素實驗的基礎上,利用Box-Behnken中心組合試驗設計對發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化。以發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵時間為考察因素,靈芝生物量為響應值,進行17組發(fā)酵實驗,利用Design Expert 8.0.6.1軟件進行響應面分析,得到優(yōu)化的工藝條件。設計3因素3水平的響應面實驗,實驗因素水平設計見表1。

表1 實驗因素水平設計Table 1 Experimental factors and levels design

1.2.6 靈芝菌質樣品的制備 待發(fā)酵結束后,將靈芝菌質(即發(fā)酵培養(yǎng)物)置于熱風循環(huán)烘箱中,于60 ℃烘干48 h至恒重,再用中藥渣分析研磨機粉碎,過60目篩,裝袋封存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 靈芝生物量的測定

1.2.7.1 繪制標準曲線 種子液培養(yǎng)出大量菌絲體后,將菌絲體烘干、研磨、過篩,分別將0.100、0.200、0.300、0.400、0.500、0.600 g菌絲體加入到25 mL 5%的三氯乙酸溶液中,于80 ℃提取25 min后,在8000 r/min 4 ℃條件下離心15 min,于波長260 nm處測定其上清液的吸光度值(OD260)[21],并繪制得到標準曲線(y=0.3979x-0.0143,R2=0.9935)。

1.2.7.2 樣品中生物量的測定 準確稱取0.250 g靈芝菌質,按1.2.7.1測定OD260值,再按照標準曲線查出其對應的生物量,若無特殊說明,實驗結果表示每克菌質中所含生物量。

1.3 數據處理

若無特別說明,每組實驗均有3個平行樣,通過SPSS 17.0軟件對單因素試驗數據進行方差分析,單因素實驗結果以平均值±標準差表示。利用Design-Expert 8.0.6軟件對Box-Behnken實驗結果進行響應面分析,優(yōu)化發(fā)酵工藝條件。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 發(fā)酵溫度對靈芝生物量的影響 在固態(tài)發(fā)酵過程中,微生物的生長代謝、菌體生長速率都會受到溫度的影響,發(fā)酵溫度對靈芝生物量的影響結果見圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對生物量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on biomass

由圖1可知,靈芝生物量開始隨著發(fā)酵溫度升高逐漸增加,在28 ℃時達到峰值,然后繼續(xù)升高溫度卻使得靈芝生物量降低。這與其他研究人員的結果基本一致,陳旭等[22]、Feng等[23]也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度在26.2～30 ℃時,靈芝生物量最高。陳紅等[24]、Lou等[25]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度為29.5～30 ℃時,靈芝菌絲體中代謝產物含量最高。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因為過高的溫度會影響靈芝菌絲體的形成和萌發(fā),導致靈芝生長遲緩;而溫度太低則影響菌體的新陳代謝,對靈芝菌體的生長及其生化反應不利,適宜的溫度有助于靈芝菌體保持較高的新陳代謝速率,代謝產酶活性較大。Asgher等[26]的研究也表明在27 ℃時靈芝產木質素降解酶的酶活較高,有助于靈芝對底物菠蘿葉渣的降解與利用,從而促進菌體的生長與繁殖,與本實驗最優(yōu)發(fā)酵溫度28 ℃接近。

2.1.2 接種量對靈芝生物量的影響 接種量的多少直接影響到微生物的生長周期,適宜的接種量可以充分利用發(fā)酵基質并縮短發(fā)酵時間。接種量對靈芝生物量的影響結果見圖2。

圖2 接種量對生物量的影響Fig.2 Effect of inoculum size on biomass

由圖2可知,在接種量為1%～15%范圍內,靈芝生物量隨著接種量增加逐漸增加,在15%時達到峰值,隨后靈芝生物量隨著接種量增加逐漸降低。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是:接種量過小時,菌質中的營養(yǎng)物質未能充分利用,延滯期增長,靈芝的生長遲緩;而接種量過大會使發(fā)酵初期靈芝菌體繁殖速度過快,大量消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質從而導致營養(yǎng)物質的缺乏,微生物會提前進入衰亡期,同時大量的代謝產物也會對靈芝的正常生長產生反饋抑制作用。徐慧等[27]利用鹿角靈芝液體發(fā)酵生產胞內多糖,實驗結果表明多糖得率最高時的接種量為11%,與本實驗最優(yōu)接種量15%接近;朱會霞[28]研究發(fā)現(xiàn)靈芝發(fā)酵產物溶出量隨著接種量的增加,呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,過低或多高的接種量均不利于靈芝的生長,優(yōu)化后的最佳接種量為10%,其生長規(guī)律與本文結果相似。

2.1.3 發(fā)酵時間對靈芝生物量的影響 發(fā)酵時間直接影響到發(fā)酵產品的質量、收率和生產成本,發(fā)酵時間對靈芝生物量的影響結果見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對生物量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on biomass

由圖3可知,在發(fā)酵前12 d靈芝生物量增長迅速,在12 d以后生物量增長明顯變緩,考慮到生產成本和發(fā)酵效果,故以12 d為最優(yōu)發(fā)酵時間開展后續(xù)工作。出現(xiàn)這種情況的主要原因可能是:發(fā)酵時間逐漸變長時,靈芝菌種逐漸適應環(huán)境,基質中被消耗的營養(yǎng)物質逐漸增多,靈芝由對數生長期進入穩(wěn)定期,同時隨著基質中的營養(yǎng)物質逐漸缺乏,微生物競爭加劇導致自溶現(xiàn)象的發(fā)生,故菌質中的生物量由快速增加變?yōu)榫徛黾印２捎貌煌囵B(yǎng)基進行發(fā)酵時,靈芝生物量增速放緩的時間差別較大,Ma等[29]的研究結果表明在16 d時生物量增速放緩,其增長規(guī)律為由快速增加過渡到緩慢增加,與本文結果類似。

2.2 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化實驗

2.2.1 響應面實驗設計與結果 根據單因素實驗結果,以接種量、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時間為影響因素,以生物量為響應值,實驗結果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

2.2.2 數學模型的建立及方差分析 利用Design Expert 8.0軟件對表2中靈芝生物量的實驗數據進行擬合,得到靈芝生物量(Y)對接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)及發(fā)酵時間(C)編碼自變量的多元模型回歸方程:

Y=0.39+0.017A+0.006525B+0.053C-0.00535AB-0.012AC+0.012BC-0.041A2-0.064B2-0.012C2。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model variance analysis

2.2.3 不同因素及其交互作用分析與優(yōu)化 利用Design Expert 8.0.6.1軟件繪制回歸模型的三維響應曲面圖,考察不同因素之間的交互作用對靈芝生物量的影響。

2.2.3.1 接種量和發(fā)酵溫度交互作用對生物量的影響 從圖4可知,接種量和發(fā)酵溫度對靈芝生物量有著不顯著的交互作用,與表3結論一致。當接種量處于低水平時,隨著發(fā)酵溫度的升高,靈芝生物量先增加后減少。

圖4 接種量和發(fā)酵溫度對生物量的影響Fig.4 Effect of inoculum size and fermentation temperature on biomass

2.2.3.2 接種量和發(fā)酵時間交互作用對生物量的影響 由圖5可知,接種量和發(fā)酵時間對靈芝生物量有著極顯著的交互作用,與表3結論一致。當接種量處于低水平時,隨著發(fā)酵時間的增加,靈芝生物量逐漸增加。

圖5 接種量和發(fā)酵時間對生物量的影響Fig.5 Effect of inoculum size and fermentation time on biomass

2.2.3.3 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間交互作用對生物量的影響 由圖6可知,發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對靈芝生物量有著極顯著的交互作用,與表3結論一致。當發(fā)酵溫度處于低水平時,隨著發(fā)酵時間的增加,靈芝生物量逐漸增加。

圖6 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對生物量的影響Fig.6 Effects of fermentation temperature and fermentation time on biomass

2.2.4 最佳工藝條件的確定及驗證實驗 以生物量為響應值,利用Design Expert 8.0.6.1軟件求解回歸方程得到的優(yōu)化的工藝條件為:接種量15.2%,發(fā)酵溫度28.4 ℃,發(fā)酵時間14 d。在此條件下,每克菌質中生物量的預測值和驗證實驗值分別為0.4327和0.4205 g,二者相對誤差為2.82%;實驗值與預測值之間無顯著差異,說明該回歸模型擬合較好,得到的優(yōu)化參數準確性高,具有一定的實用價值。

3 結論

固態(tài)發(fā)酵三七渣生產靈芝菌質為三七渣的資源化利用提供了一條新途徑,本次研究得到的回歸模型擬合度高、優(yōu)化參數的準確性高,具有一定的實用價值。經響應面分析法優(yōu)化后的發(fā)酵工藝條件為:接種量15.2%,發(fā)酵溫度28.4 ℃,發(fā)酵時間14 d,在此條件下,每克靈芝菌質中靈芝生物量為0.4205 g。