王永剛,賈文婷,劉戰(zhàn)霞,楊 慧,*

(1.鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院,河南鶴壁 458030;2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室,新疆石河子 832000)

紅棗(ZizyphusjujubeMill)又稱大棗,原產(chǎn)于中國,是我國的特色果品,種植面積及產(chǎn)量占到世界總量的98%以上[1]。紅棗營養(yǎng)豐富,富含膳食纖維、氨基酸、糖類、礦物質(zhì)、維生素等活性成分[2-5],因具有多種生理保健功能而受到人們喜愛。

膳食纖維稱為“第七營養(yǎng)素”,分為水溶性和非水溶性兩類,是一種不能被人體消化和吸收的植物性碳水化合物,主要包含纖維素、半纖維素、低聚糖、多糖、蠟質(zhì)、果膠及木質(zhì)素等[6-7]。據(jù)報道,紅棗膳食纖維在潤腸通便、調(diào)節(jié)腸道菌群[8-9]、降低血液膽固醇、甘油三酯,減肥瘦身[10-11]、抗衰老[12]、護肝、抗癌、抗腫瘤、抗菌消炎、抗氧化、抗輻射[13-15]等方面對人體均有較好的調(diào)節(jié)作用。

目前紅棗膳食纖維提取方法主要分為物理提取法(超微粉碎法、冷凍粉碎法)、化學(xué)提取法(酸法、堿法)、生物技術(shù)提取法(酶法、微生物法)等方法。其中物理提取法操作簡單,但提取率較低;化學(xué)法提取制備成本低,但制備的膳食纖維純度較低且污染環(huán)境;生物技術(shù)提取法制備的膳食纖維純度高、污染少,但生產(chǎn)周期長、成本高,不利于大規(guī)模生產(chǎn);酶法提取由于條件溫和,具有快速、高效、無污染的優(yōu)勢,同時最大程度可保留提取物的生物活性成分而成為研究的熱點[16]。因此,文章以提高紅棗膳食纖維的提取率為目的,對紅棗膳食纖維酶法提取工藝進行優(yōu)化,并對其理化性質(zhì)及抗氧化特性進行測定和評價,以期為紅棗加工企業(yè)膳食纖維產(chǎn)業(yè)化開辟新的途徑提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗 產(chǎn)自新疆阿克蘇地區(qū)駿棗;纖維素酶(10 μg/mg) 美國Sigma 公司;濃鹽酸、丙酮、氫氧化鈉、無水乙醇 均為分析純,天津市致遠化學(xué)試劑有限公司。

SWLF渦輪粉碎機 杭州旭眾機械設(shè)備有限公司;DZF-6050真空干燥箱 上海鴻都電子科技有限公司;HHW/SHHW三用電熱恒溫箱 廣東佛衡儀器有限公司;S-1-150S高速離心機 鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司;FA1004電子天平 紹興市景邁儀器設(shè)備有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵 鞏義市科瑞儀器有限公司;RE-1002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海岐耀儀器設(shè)備有限公司;BPH-7200實驗室PH計 貝爾分析儀器(大連)有限公司;752N紫外可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 預(yù)處理 紅棗經(jīng)挑選、清洗后,置于真空干燥箱內(nèi)60 ℃干燥12 h,去核后經(jīng)渦輪粉碎機粉碎,過80目篩,作為膳食纖維原料待用。

1.2.2 熱水浸提紅棗膳食纖維制備工藝流程 紅棗粉→按5∶1 mL/g液料比混合→調(diào)節(jié)pH為6.0→溫度80 ℃水浴120 min→離心分離→濃縮→醇沉→離心→冷凍干燥→粉碎→熱水浸提紅棗膳食纖維樣品。

1.2.3 酶法提取工藝流程 紅棗粉→加水→調(diào)pH→加纖維素酶酶解→滅酶(100 ℃,5 min)→離心分離→減壓濃縮→乙醇沉淀→離心→冷凍干燥→粉碎→酶法制備紅棗膳食纖維樣品。

操作要點:準(zhǔn)確稱取一定量的紅棗粉,以一定料液比加入去離子水,調(diào)節(jié)pH4.8,分別加入一定質(zhì)量分數(shù)的纖維素酶酶解一定時間,然后3000 r/min 離心 15 min,取上清液減壓濃縮,再加入無水乙醇進行浸泡過夜,離心,將沉淀冷凍干燥后用中藥粉碎機粉碎,過 60 目的篩網(wǎng),得到紅棗膳食纖維樣品。

1.2.4 紅棗膳食纖維提取工藝單因素試驗

1.2.4.1 酶添加量對提取率的影響 酶解溫度50 ℃,液料比9∶1 mL/g,酶解時間為45 min,分別研究酶添加量為0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1時對紅棗膳食纖維提取率的影響。

1.2.4.2 酶解溫度對提取率的影響 酶添加量為1.5 mg·mL-1,液料比為9∶1 mL/g,酶解時間為45 min,分別研究酶解溫度為30、40、50、60 ℃時對紅棗膳食纖維提取率的影響。

1.2.4.3 液料比對提取率的影響 酶添加量為1.5 mg·mL-1,酶解溫度為50 ℃,酶解時間為45 min,分別研究液料比為6∶1、9∶1、12∶1、15∶1 mL·g-1時對紅棗膳食纖維提取率的影響。

1.2.4.4 酶解時間對提取率的影響 酶添加量為1.5 mg·mL-1,酶解溫度為50 ℃,液料比為9∶1 mL/g,分別研究酶解時間為15、30、45、60 min時對紅棗膳食纖維提取率的影響。

1.2.5 紅棗膳食纖維提取工藝響應(yīng)面試驗 在單因素所獲得的各因素最適水平基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken的組合試驗設(shè)計原理,選取酶添加量(mg·mL-1)、酶解溫度(℃)、液料比(mL·g-1)、酶解時間(min)4個影響因素為自變量,并對其進行編碼設(shè)計,見表1。

表1 響應(yīng)面試驗水平及編碼設(shè)計表Table 1 Level and code of variables of response surface method

1.2.6 紅棗膳食纖維提取率計算 紅棗不溶性膳食纖維按GB/T 5009.88-2014《食品中膳食纖維的測定》進行。紅棗膳食纖維提取率按公式(1)計算[17]。

式(1)

1.2.7 膳食纖理化性質(zhì)研究

1.2.7.1 膳食纖維持水力測定 準(zhǔn)確稱取膳食纖維干樣0.100 g(精確至0.001 g,下同),放入干燥離心管中,稱重。加入10 mL蒸餾水,搖勻,室溫靜置1 h,在3500 r/min離心30 min,棄上清液后稱重,持水力為兩次離心管質(zhì)量之差[18]。

1.2.7.2 膳食纖維持油力測定 準(zhǔn)確稱取膳食纖維干樣 0.1 g,置于離心管中,稱重。加入10 mL菜籽油,搖勻,室溫靜置1 h,于3500 r/min離心30 min,棄上清液后稱重。持油力為兩次離心管質(zhì)量之差[18]。

1.2.7.3 膳食纖維膨脹力測定 準(zhǔn)確稱量膳食纖維干樣 0.1 g,置于 10 mL刻度試管中,讀取干樣體積(V0),加 10 mL 蒸餾水,搖勻,室溫放置 24 h,讀取膳食纖維體積(V1),按公式(2)計算膨脹力[18]。

膨脹力(mL/g)=(V1-V0)/0.1

式(2)

1.2.7.4 膳食纖維陽離子交換力測定 稱取 0.5 g 膳食纖維干樣,加0.1 mol/L 的鹽酸30 mL,搖勻,室溫放置 24 h。用蒸餾水反復(fù)清洗除去多余的酸,干燥。稱取酸化后的膳食纖維0.3 g放入三角瓶中,加入100 mL 5% NaCl溶液,磁力攪拌30 min,以 0.5% 的酚酞乙醇溶液為指示劑,0.1 mol/L 的NaOH溶液滴定,測定消耗的NaOH的體積(V0)。用蒸餾水代替HCl,測定空白消耗的NaOH的體積(V1)。按公式(3)計算陽離子交換能力[18]。

陽離子交換力(mL/g)=(V0-V1)×0.1/0.5

式(3)

1.2.8 DPPH·清除率測定 參考王小媛等[19]的方法,略有修改。于10 mL 比色管中加入待測液2和4 mL 0.1 mmol/L DPPH·溶液混合均勻,放置室溫30 min后于517 nm測吸光值(A1)。以乙醇溶劑代替DPPH·溶液測定吸光值(A2),以蒸餾水代替待測液作空白對照實驗,測定吸光值(A3),以VC溶液做陽性對照實驗清除率。計算如公式(4)。

式(4)

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”標(biāo)識。采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計和分析制圖,并進行二次回歸方程模擬和ANOVA方差分析;P<0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棗膳食纖維提取單因素實驗

2.1.1 酶添加量對紅棗膳食纖維提取率的影響 酶添加量對紅棗膳食纖維提取率的影響如圖1所示。隨著酶添加量的逐漸增加,紅棗膳食纖維提取率呈現(xiàn)升高趨勢,當(dāng)添加量為2.0 mg·mL-1時,提取率最高,達到8.56%。原因可能是纖維素酶濃度的提高增大了與底物的接觸面積,使得加快了酶促反應(yīng)速度從而使得率上升。通過組間比較,發(fā)現(xiàn)酶添加量為1.5和2.0 mg·mL-1時,提取率無顯著差異,考慮到增加酶用量將會增加成本,因此選擇酶添加量1.5 mg·mL-1比較合適。

圖1 酶添加量對紅棗膳食纖維提取率的影響Fig.1 The effect of different enzyme volume on the extract yield注:不同字母間表示具有顯著性差異,相同字母表示無顯著性差異,圖2～圖4同。

2.1.2 酶解溫度對紅棗膳食纖維提取率的影響 酶解溫度對紅棗膳食纖維提取率的影響如圖2所示。從圖2可知,隨著反應(yīng)溫度的提高,紅棗膳食纖維提取率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢,在50 ℃時達到最大8.49%,50 ℃后下降?？赡苁怯捎跍囟壬邔?dǎo)致酶失活,酶解反應(yīng)受到抑制,從而導(dǎo)致提取率降低。從統(tǒng)計學(xué)角度看,其余實驗組與50 ℃處理組相比,均具有顯著性差異,因此選擇酶解溫度為50 ℃。

圖2 酶解溫度對紅棗膳食纖維提取率的影響Fig.2 The effect of different temperature on the extract yield

2.1.3 液料比對紅棗膳食纖維提取率的影響 液料比對紅棗膳食纖維提取率的影響如圖3所示。從圖3可知,隨著液料比的提高,紅棗膳食纖維提取率呈現(xiàn)上升趨勢,液料比為15∶1 mL/g時提取率最大,達到8.42%。但是在9∶1 mL/g之后,上升趨勢變緩,且與后兩組相比無顯著性差異。因此,從經(jīng)濟成本角度分析,選擇液料比9∶1 mL/g較為合適。

圖3 液料比對紅棗膳食纖維提取率的影響Fig.3 The effect of different liquid solid ratio on the extract yield

2.1.4 酶解時間對紅棗膳食纖維提取率的影響 酶解時間對紅棗膳食纖維提取率的影響如圖4所示。隨著反應(yīng)時間的延長,紅棗膳食纖維提取率逐步提高,60 min時達到最大值8.46%,但在45 min以后上升趨勢不明顯,分析原因是45 min時酶與底物已充分結(jié)合,且與60 min組間相比無顯著差異。因此,為減少因酶解時間增加而帶來的能源浪費,選擇45 min較為合適。

圖4 酶解時間對紅棗膳食纖維提取率的影響Fig.4 The effect of time on the extract yield

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

按照軟件設(shè)計共29個試驗,其中1～24個試驗為析因?qū)嶒?25～29是中心點試驗,重復(fù)5次。其中析因點為自變量,取值在由四個因素構(gòu)成的三維頂點;0點為區(qū)域的中心點,用來估算試驗誤差。對上述各因素進行編碼,以紅棗膳食纖維提取率為響應(yīng)值,試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface method

2.2.1 優(yōu)化效應(yīng)模式 在響應(yīng)面試驗中,選取哪種效應(yīng)模式不僅對數(shù)據(jù)分析尤為關(guān)鍵,同時也是得到最適模型的關(guān)鍵,通過Design-Expert 8.0.6軟件對實驗數(shù)據(jù)進行線性(Linear)、兩因子交互作用(2FI)和二階效應(yīng)(Quadratic)三種效應(yīng)模式方差分析,結(jié)果如表3所示。

表3 不同效應(yīng)模式方差分析表Table 3 Analysis of variance of different effect model

由表3可知,線性(Linear)及兩因子交互作用(2FI)模式下的回歸項,模型P值為0.6566及0.9117,代表65.7%和91.1%的F值變異是由誤差造成的,兩種模式的失擬項均小于0.01(0.0059、0.0039),說明這兩種模型下的回歸方程擬合度較差。而在二階效應(yīng)(Quadratic)的模型下,回歸方程系數(shù)R2=0.9349,不良適配度僅有0.0651,說明響應(yīng)值紅棗膳食纖維提取率的變化有93.49%源于各自變量的變化,呈現(xiàn)高比例擬合,建立的模型準(zhǔn)確度高。模型P值<0.0001,該模型回歸極顯著;失擬項大于0.05(0.2217),不顯著,說明該回歸方程在回歸空間內(nèi)有很好的擬合度,可有效進行預(yù)測。因此,選擇二階效應(yīng)模型對數(shù)據(jù)進行模型分析,響應(yīng)面方差分析結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface method

由表4方差分析結(jié)果顯示,一次項中C和交互作用中BD對紅棗膳食纖維提取率影響顯著(P<0.05);一次項A、交互作用AD及二次項A2、B2、C2、D2對紅棗膳食纖維提取率影響極顯著(P<0.01),說明回歸模型的響應(yīng)值變化不是簡單的線性關(guān)系,曲面效應(yīng)顯著。根據(jù)參數(shù)分析結(jié)果得到紅棗膳食纖維的回歸模型為:

Y=9.18-0.29A-0075B-0.21C+0.13D-0.28AB-0.18AC+0.48AD+0.15BC-0.35BD+0.1CD-0.92A2-0.95B2-0.87C2-0.97D2。

此回歸模型的R2=0.9349,F=14.36,P<0.0001,說明模型在概率a=0.01水平上能夠擬合試驗數(shù)據(jù),因此可利用該回歸方程來確定最佳因素水平。

2.2.2 各因素相互作用 各因素之間交互作用影響可通過圖5所展示的響應(yīng)面三維圖及等高線圖反映。通過等高線的形狀可反映出交互作用的大小,橢圓形表示較大,而圓形則與之相反。通過等高線可以看出酶添加量與酶解時間、酶解溫度與酶解時間之間交互作用顯著,與方差分析表中結(jié)論相同(表4)。還可以看出,響應(yīng)擬合面具有真實的最大響應(yīng)值,過高或過低的各因素水平對提取率均有不利的影響,此結(jié)論與單因素試驗結(jié)果一致(圖1～圖4)。

圖5 各因素相互作用對提取率的響應(yīng)面圖Fig.5 Surface response plot of elements interaction on extract yield

2.2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化及模型驗證 采用Design Expert 軟件進行分析,優(yōu)化得到紅棗膳食纖維最佳提取條件為:酶添加量1.47 mg·mL-1,酶解溫度49.83 ℃,液料比8.89∶1 mL/g,酶解時間45.32 min,提取率為9.21%。

考慮到操作的可行性,將上述條件略微調(diào)整為酶添加量為1.5 mg·mL-1,酶解溫度為50 ℃,液料比為9∶1 mL/g,酶解時間45 min,進行5組重復(fù)試驗,最后得到膳食纖維提取率平均值為9.18%,與預(yù)測值誤差僅為0.33%,表明試驗結(jié)果與模型預(yù)測擬合較好,建立的回歸模型能真實準(zhǔn)確的反應(yīng)酶添加量、酶解溫度、液料比及酶解時間對紅棗膳食纖維提取率的影響,通過此模型優(yōu)化能夠有效優(yōu)化紅棗膳食纖維的提取工藝。

2.3 紅棗膳食纖維理化性質(zhì)研究

持水力、持油力、膨脹力、離子交換能力是影響膳食纖維生理功能的重要指標(biāo)[20]。持水性和膨脹性具有增加飽腹感,使人不易產(chǎn)生饑餓感,持油性可以通過吸附食物中的油脂減少人體對脂肪的攝入量,達到減肥的目的。陽離子交換能力可提高陽離子在腸道中與膳食纖維結(jié)合隨糞便或尿液排出體外,調(diào)節(jié)血液中的Na+、K+比,產(chǎn)生降壓效果。熱水提取和酶法提取的膳食纖維理化指標(biāo)的對比結(jié)果見表5。從結(jié)果可知,酶法提取在持水力、持油力、膨脹力、離子交換能力方面均比熱水提取有顯著提升。原因可能是酶法提取條件比較溫和,不易破壞膳食纖維本身的活性成分。

表5 不同提取方法紅棗膳食纖維理化性質(zhì)Table 5 Physical and chemical characteristics of fiber extracted by different methods

2.4 紅棗膳食纖維抗氧化性研究

過多的自由基可誘發(fā)機體的組織和細胞受到損害,從而引起慢性疾病及有機體衰老。研究表明清除體內(nèi)多余自由基對于某些疾病的預(yù)防和治療意義重大,清除DPPH·是一種常用的體外抗氧化方法[21-23]。以抗壞血酸(VC)為對照,清除DPPH·的結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示,在0.05～0.80 mg·mL-1濃度范圍內(nèi),紅棗膳食纖維和VC對DPPH·清除率呈現(xiàn)相同的趨勢,均隨著濃度的增加而增強,后逐漸平緩,紅棗膳食纖維和VC的最高清除率分別為79.1%和82.3%,相差3.8%。根據(jù)線性回歸方程計算,紅棗膳食纖維的IC50=0.227 mg·mL-1,VC的IC50=0.191 mg·mL-1,在0.05～0.80 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明,紅棗膳食纖維抗氧化活性較高,該結(jié)論與他人研究結(jié)果相一致[24-25]。

圖6 紅棗膳食纖維清除DPPH·能力Fig.6 DPPH· scavenging activity of Zizyphus jujube dietary fiber

3 結(jié)論

通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗確定了紅棗膳食纖維酶法提取的最佳工藝條件為:酶添加量1.5 mg·mL-1,酶解溫度50 ℃,液料比9∶1 mL/g,酶解時間45 min。在此條件下,紅棗膳食纖維提取率為9.18%。對比酶法和熱水浸提紅棗膳食纖維的理化性質(zhì)研究結(jié)果表明,酶法提取膳食纖維持水力、膨脹力、持油力和陽離子交換力均有顯著提升。以VC為對照,進行了紅棗膳食纖維樣品清除DPPH·的能力試驗,結(jié)果表明,紅棗膳食纖維和VC清除率呈現(xiàn)相同的趨勢,清除率分別為79.1%和82.3%,相差3.8%,顯示了其較高的抗氧化活性。紅棗膳食纖維抗氧化特性目前僅在清除DPPH·方面做了些工作,后續(xù)還要從清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、ABTS+·等多角度全方位評價紅棗膳食纖維抗氧化功效,為開發(fā)相關(guān)膳食纖維產(chǎn)品提供理論支撐,同時還應(yīng)探索紅棗膳食纖維結(jié)構(gòu)與功能成分之間的量效關(guān)系問題。