潘大宇，寧廣智，馮世慶

（天津醫(yī)科大學總醫(yī)院骨科，天津市神經(jīng)科學院，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)損傷后神經(jīng)修復(fù)和再生教育部重點實驗室，天津 300052）

脊髓損傷（spinal cord injury,SCI）后軸突嚴重受損和神經(jīng)元死亡，導致運動和/或感覺功能永久喪失，影響脊髓通過大腦向身體損傷部位以下控制感覺、運動以及自主功能的系統(tǒng)傳遞信息的能力[1-5]。雪旺細胞的外表面有基膜，能夠分泌營養(yǎng)因子來支持軸突生長，包括神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)細胞系神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)素[6-8]，能夠促進損傷后軸突的去分化和增殖，去除髓鞘和軸突碎片，其再生能力已被用于修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的損傷[9]。外泌體首先是在20世紀80年代被發(fā)現(xiàn)，并被描述為網(wǎng)狀細胞分泌的內(nèi)體衍生的小囊泡（30～150 nm），包含復(fù)雜的RNA和蛋白質(zhì)，直徑為40～100 nm的盤狀囊泡[10-11]。外泌體能夠充當信號傳導體并將生物活性分子傳遞至特定的受體細胞以進行細胞間通訊[12]。研究表明，外泌體參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nerve system，CNS）的許多生物學過程，如突觸可塑性、髓鞘膜生物發(fā)生的調(diào)節(jié)以及將蛋白質(zhì)或者核酸局部轉(zhuǎn)運至高度極化的結(jié)構(gòu)[13-14]。而雪旺細胞外泌體（schwann cell-derived exosomes，SCDEs）最近引起了越來越多實驗團隊的注意，已經(jīng)有研究結(jié)果顯示，SCDEs包含mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)，并能夠在體內(nèi)外增強軸突的再生[17-18]。因此，本研究的目的是研究小鼠脊髓損傷后SCDEs在功能修復(fù)的作用及其可能的機制。本研究的發(fā)現(xiàn)可能有助于開發(fā)治療臨床脊髓損傷的新型治療策略。

1 材料與方法

1.1 雪旺細胞的原代提取和培養(yǎng) 由于雪旺細胞存在于外周神經(jīng)，所以本研究選擇大的外周神經(jīng)坐骨神經(jīng)來提取雪旺細胞。首先麻醉小鼠，然后使用頸椎脫臼法處死小鼠并用75%的乙醇全身消毒。將坐骨神經(jīng)分離出來后匯集到裝有無菌PBS的培養(yǎng)皿中，然后抽出PBS加入1 mL DMEM培養(yǎng)基（dulbecco′s modified eagle′s medium，DMEM） 和 300 μL 10 mg/mL 膠原酶孵育消化并分別用1 mL移液器吸頭、18 G和21 G針頭多次吸出和吹打組織，然后將細胞懸液通過70μm細胞過濾器濾入離心管中，500×g離心10 min后，丟棄上清液，用10 mL DMEM重疊細胞沉淀，輕輕搖動以均勻分布細胞，轉(zhuǎn)入到5%CO2的37℃恒溫箱中培養(yǎng)細胞1 d。第2天更換培養(yǎng)基。

1.2 SCDEs的提取 當雪旺細胞傳至足夠的皿數(shù)并具有一定細胞密度后，更換培養(yǎng)基為不含F(xiàn)BS的DMEM進行培養(yǎng)，并每3 d收集1次雪旺細胞培養(yǎng)基，將收集到的培養(yǎng)基通過多次超速離心獲得SCDEs。第1次以1 000×g離心10 min，第2次以10 000×g離心30min。隨后，第3次收集上清液，并在100000×g下超速離心1h以沉淀外泌體。用PBS洗滌SCDEs后，在100 000×g下超速離心最后1 h后得到SCDEs。

1.3 SCDEs鑒定 先使用醋酸戊酯浸沒處理1 h，再用蒸餾水沖洗3次，然后浸沒在無水乙醇中以去除銅網(wǎng)上的污物，在無菌容器中備有一定量的無菌水，然后加入2%的火棉膠醋酸戊酯溶液于液面中央來制備支持膜，通過控制無菌水水流流速將支持膜轉(zhuǎn)移到載網(wǎng)上，然后制片后在透射電鏡下觀察。

1.4 SCI動物模型的建立和外泌體治療 由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心獲得6～8周齡雌性C57小鼠24只。給小鼠提供足夠的標準食物和水，并在12 h/12 h的明暗周期下飼養(yǎng)。術(shù)前稱重，并通過腹膜內(nèi)注射3 mL/kg的4%水合氯醛對小鼠進行深度麻醉。使用顯微剪對T10椎骨進行背側(cè)椎板切除術(shù)以暴露脊髓，將微型止血鉗橫向鉗夾暴露處整個脊髓5 s后松開，可觀察到小鼠痙攣性擺尾，雙下肢及軀體回縮撲動后雙下肢癱瘓，以及硬脊膜充血水腫，從而造成脊髓挫傷模型。假手術(shù)組除了不進行脊髓鉗夾，其他操作與上述操作一致。SCDEs治療組和PBS組均通過尾靜脈注射，每周2次，每次 3 μL/只。

1.5 免疫熒光染色 首先灌注取材，取出脊髓后4%多聚甲醛固定24 h，轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液中脫水24 h，然后冰凍包埋后切片，厚度為10 μm，置于37℃烘箱中烘烤1 h，后使用PBS復(fù)水5 min，加入封閉液封閉1 h，然后孵育一抗，置于濕盒中4℃過夜，所用一抗為5-HT、β-Ⅲ-tublin和GFAP。第2天將濕盒取出常溫復(fù)溫1h后用TBST洗3次，每次10min，避光常溫孵育二抗1 h。孵育完成后使用TBST洗3次，每次10 min，甘油封片后顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均表示為x±s。通過GraphPadPrism7軟件進行統(tǒng)計分析，并使用Student′st檢驗進行成對比較。使用帶有Tukey事后檢驗的Two-way ANOVAs分析確定行為學分析中的顯著差異，包括重復(fù)的數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SCDEs鑒定 本研究選用透射電子顯微鏡來觀測外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，SCDEs的直徑范圍為40～100 nm，證實已經(jīng)分離出SCDEs（圖 1）。

圖1 SCDEs鑒定Fig 1 Identification of SCDEs

2.2 BMS評分 對于體內(nèi)實驗，本研究評估了SCI后使用 PBS 和使用 SCDEs治療第 1、3、5、7、14、28、42及56天的小鼠的恢復(fù)情況。通過對小鼠后肢運動功能評價，本研究發(fā)現(xiàn)在SCDEs治療組和PBS治療組小鼠的BMS評分之間存在統(tǒng)計學上顯著的時間依賴性變化，第28天P＜0.05，第42天P＜0.01，第56天P＜0.001。該發(fā)現(xiàn)表明，SCDEs改善了SCI后運動功能的恢復(fù)（圖2）。

圖2 BMS評分Fig 2 BMS score

2.3 SCDEs促進SCI后的神經(jīng)保護 為了研究SCDEs是否能夠促進SCI后的神經(jīng)保護，本研究在小鼠損傷部位檢測了5-HT和β-Ⅲ-tublin的表達水平。免疫熒光的結(jié)果表明，SCI后，和PBS處理組相比，SCDEs治療組的5-HT標記的神經(jīng)遞質(zhì)向下傳遞增多，同時β-Ⅲ-tublin標記的神經(jīng)在損傷區(qū)的分布密度增加而且損傷部位兩側(cè)正常神經(jīng)結(jié)構(gòu)的距離縮短（圖3）。

圖3 SCDEs對SCI后神經(jīng)保護的影響Fig 3 Effects of SCDEs on neuron protection after SCI

2.4 SCDEs促進SCI后神經(jīng)保護的定量分析 定量分析的結(jié)果表明，和PBS處理組相比，SCDEs治療組的5-HT和β-Ⅲ-tublin含量增高且差異具有統(tǒng)計學意義（圖 4，P＜0.01，P＜0.05）。

圖4 SCDEs對SCI后神經(jīng)保護的定量分析Fig 4 Quantitative data of SCDEs induced neuron protection after SCI

2.5 SCDEs治療增加SCI后膠質(zhì)瘢痕的形成 為探索SCDEs促進神經(jīng)學功能恢復(fù)的機制，通過檢測GFAP表達水平來觀察膠質(zhì)瘢痕的變化情況，免疫熒光的數(shù)據(jù)顯示，與PBS組相比，SCDEs組膠質(zhì)瘢痕表達增加，并且生長密度和延伸趨勢明顯（圖5）。

圖5 SCDEs對膠質(zhì)瘢痕形成的影響Fig 5 Effects of SCDEs on glial scar formation

2.6 SCDEs治療增加SCI后膠質(zhì)瘢痕形成的定量分析 定量分析的結(jié)果表明，與PBS組相比，SCDEs組膠質(zhì)瘢痕表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義（圖6）。

圖6 SCDEs對膠質(zhì)瘢痕形成影響的定量分析Fig 6 Quantitative data of SCDEs affected glial scar formation

3 討論

本研究通過提取原代雪旺細胞并從其培養(yǎng)上清中超速離心出SCDEs，與PBS組相比，SCDEs組小鼠的行為學功能改善，神經(jīng)學功能指標具有顯著性改善，同時膠質(zhì)瘢痕形成增加。以上結(jié)果表明，SCDEs可以通過影響膠質(zhì)瘢痕的形成，從而增加神經(jīng)元的存活和修復(fù)小鼠脊髓損傷。

在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，軸突在神經(jīng)損傷后有效地再生，雪旺細胞在其中發(fā)揮重要作用[15]，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，由于神經(jīng)元固有的局限性和限制再生的纖維瘢痕，再生能力差[16]。最近，有研究表明SCDEs包含mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)，并在體外和體內(nèi)增強軸突再生[17-18]。此外，該研究還證明，p75NTR存在于SCDEs中，是一種前體再生的蛋白質(zhì)。該蛋白在去分化的雪旺細胞中高表達，在病變區(qū)域豐富，并且p75NTR通過RhoA來調(diào)節(jié)生長錐狀絲狀偽足[14]。因此SCDEs的神經(jīng)保護作用越來越受到關(guān)注。但是真正將SCDEs應(yīng)用于中樞神經(jīng)損傷治療的研究屈指可數(shù)，本研究使用超速離心法分離出SCDEs進行小鼠脊髓損傷治療，觀察到SCDEs具有神經(jīng)保護作用，并可恢復(fù)小鼠行為學功能，由于SCDEs獲取相對比較困難，耗費時間長且成本投入高，所以如何更快更好的獲取足量的SCDEs可能是臨床轉(zhuǎn)化中一個非常重要的限制因素。

近年來，對于膠質(zhì)瘢痕的作用褒貶不一，之前很多學者認為膠質(zhì)瘢痕在SCI后更多的扮演一個物理阻隔的作用，限制了軸突的再生和神經(jīng)元的存活，而目前越來越多的研究顯示，膠質(zhì)瘢痕主要由星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞等構(gòu)成，這些細胞本身就是構(gòu)成軸突和支撐神經(jīng)元的重要膠質(zhì)細胞，所以它們的存在可以促進軸突的再生和神經(jīng)元的存活[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘢痕可以受到SCDEs的激活而表達增多，從而促進脊髓損傷后運動功能以及神經(jīng)學功能的修復(fù)，但是SCDEs如何影響膠質(zhì)瘢痕形成的機制還有待進一步研究。