李甜甜，蔣大偉，姬鵬超，王銀鈴，張改平,3

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002； 3.江蘇高校動(dòng)物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的雛雞的一種急性、高度傳染性的免疫抑制性疾病[1]。自該病被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在世界各地廣泛流行，隨后變異毒株、強(qiáng)毒株及超強(qiáng)毒株的不斷出現(xiàn)，使得傳統(tǒng)疫苗不能為宿主提供有效的免疫保護(hù)，從而對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的危害[2]。

IBDV屬于雙RNA病毒科、禽雙RNA病毒屬，其基因組由A和B 2個(gè)片段組成，共編碼5種蛋白質(zhì)，分別為VP1、VP2、VP3、VP4和VP5[3]。其中VP2是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白和主要宿主保護(hù)性抗原，包含了誘導(dǎo)病毒中和抗體的抗原區(qū)域，其誘導(dǎo)的中和抗體能保護(hù)宿主不受IBDV感染[4-5]。此外，VP2與抗原變異和病毒毒力密切相關(guān)[6]。因此，VP2一直是研究IBD亞單位疫苗的目標(biāo)蛋白。

目前，VP2蛋白已在多種表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，如大腸桿菌[7]、昆蟲(chóng)細(xì)胞[8]、酵母[9]和植物[10]等。其中，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VP2蛋白具有良好的免疫原性，但生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低、純化方法復(fù)雜，不易于工業(yè)生產(chǎn)[11-12]。相比之下，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長(zhǎng)速度快、操作簡(jiǎn)便、成本低、可用于發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[13]。研究者常選擇親和層析[14]、凝膠過(guò)濾、蔗糖梯度離心[15]和氯化銫梯度離心[16]等方法純化目的蛋白，其中親和層析純化的蛋白質(zhì)需要經(jīng)透析去除咪唑，此過(guò)程蛋白質(zhì)容易發(fā)生聚集析出，不適用疫苗的制備，其他方法由于操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)或需要特殊設(shè)備等問(wèn)題不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。而鹽沉淀法[17]、離子交換層析[18]、疏水相互作用層析等具有低成本、易操作、可用于大量蛋白質(zhì)純化的特點(diǎn)，對(duì)于工業(yè)純化蛋白質(zhì)是很好的選擇。為了獲得可用于工業(yè)生產(chǎn)的高通量及大規(guī)模純化VP2蛋白的方法，利用大腸桿菌表達(dá)VP2蛋白，并經(jīng)飽和硫酸銨沉淀和離子交換層析等方法進(jìn)行純化以獲得純度較高的目的蛋白，并檢測(cè)其免疫原性，以期為進(jìn)一步研究IBD亞單位疫苗和建立IBDV檢測(cè)方法提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒

pET28a-VP2重組質(zhì)粒由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)室驗(yàn)室構(gòu)建并保存，JM109感受態(tài)細(xì)胞和BL21( DE3 )感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、DL2000 DNA Marker、λHind Ⅲ DNA Marker等均購(gòu)自大連寶生物公司；IPTG、彩虹180廣譜蛋白質(zhì)Marker和BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒等均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；His-Tag單克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司；羊抗鼠IgG-HRP二抗購(gòu)自Abbkine公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自新賽美生物技術(shù)有限公司；Q SepharoseTMFast Flow和DEAE SepharoseTMFast Flow均購(gòu)自GE Healthcare公司； IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性抗原、IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性抗體和IBDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株BC6/85等均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；IBDV ELISA試劑盒購(gòu)自北京天之泰生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 供試動(dòng)物

30只3周齡SPF雞購(gòu)自山東斯派福瑞公司。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒(pET28a-VP2)轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒用BamHⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定并送公司測(cè)序。

1.5 VP2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

1.5.1 誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的重組質(zhì)粒 pET28a-VP2轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那抗性的LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，然后挑取單菌落接種到含100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.5，加入誘導(dǎo)劑 IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，于37 ℃培養(yǎng)16 h。收集培養(yǎng)后的菌液于10 000 r/min 離心10 min，棄去上清收集菌體，用PBS緩沖液重懸菌體，并進(jìn)行超聲破碎(振動(dòng)頻率50 Hz，工作4 s，間歇6 s，持續(xù)10 min)，破碎后，于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，分離上清與沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色并脫色，觀察結(jié)果。

1.5.2 Western blot鑒定 誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后，經(jīng)半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶室溫封閉2 h后，一抗為1∶3 000稀釋的His-Tag單克隆抗體，37 ℃ 孵育1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，二抗為1∶1 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，37 ℃ 孵育1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，ECL顯色液顯色。

1.5.3 AGP檢測(cè) 制備瓊脂平板，用梅花打孔器在瓊脂平板上打孔，在瓊脂平板中間孔加IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性抗體，外周孔加IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性抗原和PBS稀釋的VP2蛋白，且依次按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢傊桨迤椒旁跐窈袃?nèi)，于37 ℃溫箱中孵育2～3 d，以測(cè)定VP2蛋白表達(dá)量。

1.6 VP2蛋白純化條件的優(yōu)化

1.6.1 飽和硫酸銨沉淀法純化VP2蛋白 利用飽和硫酸銨沉淀蛋白的方法，純化1.5.1中收獲的上清。上清液中加入飽和硫酸銨溶液，至飽和硫酸銨體積百分比為10%，充分混懸，4 ℃放置10 min；10 000 r/min離心10 min，分離沉淀與上清，再向上清中繼續(xù)加入飽和硫酸銨溶液，使其百分比從10%升高到20%，同上操作，依次增至30%、40%、50%、60%、70%，每次離心保留的沉淀用離子交換層析所使用的Binding Buffer進(jìn)行重懸，并處理樣品，進(jìn)行SDS-PAGE與Western blot分析。

1.6.2 離子交換層析填料及洗脫液濃度的優(yōu)化 上清液中加入飽和硫酸銨溶液至終含量為30%，4 ℃放置10 min；10 000 r/min離心10 min，沉淀用Binding Buffer(30 mmol/L PB，pH值為7.0)充分混懸，透析，除鹽并使用0.45 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾。得到的樣品分別利用DEAE SepharoseTMFast Flow(DEAE)和Q SepharoseTM Fast Flow(Q)進(jìn)行純化，流速2 mL/min，Binding Buffer平衡5個(gè)柱體積后上樣，之后依次使用含200、300、500 mmol/L NaCl的緩沖液(pH值為7.0)洗脫蛋白質(zhì)，收集洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6.3 離子交換層析緩沖液pH值的優(yōu)化 分別使用不同pH值(6.5、7.0、7.5、8.0)的緩沖液對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，流速2 mL/min，Binding Buffer平衡5個(gè)柱體積后上樣，之后使用含200 mmol/L NaCl的緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.7 動(dòng)物試驗(yàn)

將30只雞隨機(jī)分為3組，每組10只，A組：VP2蛋白；B組：VP2蛋白加MontanideTMISA 71 VG佐劑；C組：PBS陰性對(duì)照組。均采用肌肉注射的方式進(jìn)行免疫，免疫劑量為200 μL(10 μg/羽)，分別在免疫后的第7、14、21、28 天，翅下靜脈采血并分離血清，采用IBDV ELISA試劑盒檢測(cè)抗體效價(jià)。

1.8 病毒攻毒試驗(yàn)

在免疫28 d后，用IBDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株BC6/85進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，攻毒劑量為10-5BID50。攻毒后觀察雞的臨床癥狀，4 d后剖檢供試雞，觀察腿肌、法氏囊等組織的病理變化，稱(chēng)量體質(zhì)量和法氏囊質(zhì)量，并計(jì)算囊重比和囊指數(shù)。囊重比=法氏囊質(zhì)量/體質(zhì)量×1 000；囊指數(shù)=試驗(yàn)組囊重比/空白對(duì)照組囊重比。

1.9 法氏囊組織學(xué)病理檢測(cè)

取出雞法氏囊組織置于10%甲醛溶液中固定，之后用石蠟包埋，切片，HE染色，觀察組織病理學(xué)變化，判定法氏囊組織學(xué)損傷分?jǐn)?shù)(1—4)。1分：正常的淋巴濾泡或淋巴細(xì)胞減少，無(wú)任何局灶性壞死或明顯水腫的跡象；2分：中度淋巴損傷，伴有局灶性壞死；3分：嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞損傷，幾乎沒(méi)有淋巴細(xì)胞，有網(wǎng)狀細(xì)胞和增生的纖維組織；4分：卵泡萎縮，有明顯的纖維化。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET28a-VP2的酶切鑒定

從活化的重組菌JM109(pET28a-VP2)菌液中提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，獲得的目的片段及載體的大小分別與預(yù)期片段大小一致(圖1)，表明連接的重組載體pET28a-VP2構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果也表明，重組載體中的VP2片段序列正確。

2.2 VP2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

重組菌(pET28a-VP2)在37 ℃、0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)16 h后，離心收集菌體，超聲破碎后分別收集上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE與Western blot檢測(cè)。SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖2A)，在分子質(zhì)量50 ku處有表達(dá)條帶，與VP2蛋白預(yù)期大小一致。此外，破碎沉淀中條帶更明顯，說(shuō)明表達(dá)的目的蛋白主要以包涵體形式出現(xiàn)。Western blot結(jié)果(圖2B)與SDS-PAGE中的目標(biāo)條帶一致，表明VP2蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3)，表達(dá)的VP2蛋白可以與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性抗體反應(yīng)形成沉淀線(xiàn)，效價(jià)為1∶16，表明其具有良好的反應(yīng)原性。

A:SDS-PAGE鑒定;B:Western blot鑒定。

0:IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性抗體;1:IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性抗原;

2.3 VP2蛋白純化條件的優(yōu)化

2.3.1 飽和硫酸銨純化蛋白質(zhì) 硫酸銨沉淀常用于蛋白質(zhì)的粗純,它根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的不同而使其先后沉淀。不同含量的飽和硫酸銨溶液沉淀蛋白質(zhì)結(jié)果顯示(圖4)，表達(dá)的目的蛋白經(jīng)30%的飽和硫酸銨溶液沉淀可除去部分雜蛋白，達(dá)到粗純的目的。

A:SDS-PAGE鑒定;B:Western blot鑒定。M:蛋白質(zhì)Marker;1:細(xì)菌裂解液上清;2—8:梯度飽和硫酸銨(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%)

2.3.2 填料及洗脫濃度的確定 飽和硫酸銨純化得到的目的蛋白再分別利用DEAE SepharoseTMFast Flow和Q SepharoseTMFast Flow進(jìn)行純化。其中DEAE SepharoseTMFast Flow純化蛋白質(zhì)的SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖5A)，含200 mmol/L NaCl的緩沖液可洗脫目的蛋白，但不能有效去除雜蛋白，得到的目的蛋白純度低；Q SepharoseTMFast Flow純化蛋白質(zhì)的SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖5B)，含200 mmol/L NaCl的緩沖液可洗脫目的蛋白，并且目的蛋白純度較高，純化效果良好。可見(jiàn)，Q SepharoseTMFast Flow適合用于純化VP2蛋白。

2.3.3 緩沖液pH值的確定 使用不同pH值(6.5、7.0、7.5、8.0)的緩沖液純化蛋白質(zhì)，SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖6A)，隨著緩沖液pH值的增加，洗脫的目的蛋白純度越高，最適合純化目的蛋白的緩沖液pH值為8.0，得到的VP2蛋白純度最高可達(dá)到80%。Western blot結(jié)果顯示(圖6B)，經(jīng)純化的VP2蛋白能被His-Tag單克隆抗體特異性識(shí)別，

A:DEAE SepharoseTM Fast Flow;B:Q SepharoseTM Fast Flow。M:蛋白質(zhì)Marker;1:30%飽和硫酸銨;2:流穿液;3,7:200 mmol/L NaCl;4—5:300 mmol/L NaCl;6:500 mmol/L NaCl A:DEAE SepharoseTM Fast Flow;B:Q SepharoseTM Fast Flow.M:Protein Marker;1:30% saturated ammonium sulfate;2:Flow-through fluid;3,7:200 mmol/L NaCl;4—5:300 mmol/L NaCl;6:500 mmol/L NaCl

A:SDS-PAGE鑒定;B:Western blot鑒定。a—d:緩沖液pH值分別為6.5、7.0、7.5、8.0;M:蛋白質(zhì)Maker;1,5:30%飽和硫酸銨;2—4,6—8:200 mmol/L NaCl;9:緩沖液pH值為8.0純化的VP2蛋白

表明純化的VP2蛋白具有良好的反應(yīng)原性。純化的VP2蛋白經(jīng)BCA蛋白質(zhì)濃度試劑盒測(cè)定，其質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL。

2.4 VP2蛋白免疫原性分析

純化的VP2蛋白作為抗原免疫SPF雞，并將每周采集的血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。從圖7可以看出，免疫7 d后，抗原組均可檢測(cè)到抗體，并且抗體滴度逐步提升，其中，VP2組到第21天時(shí)達(dá)到最高，VP2加佐劑組到第28天時(shí)達(dá)到最高。此外，在免疫14 d后，VP2加佐劑組產(chǎn)生的抗體滴度明顯高于VP2組。這表明純化的VP2蛋白免疫原性良好，可有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。

2.5 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

免疫28 d后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，BC6/85毒株僅引起機(jī)體免疫抑制，幾乎不導(dǎo)致死亡。在本試驗(yàn)中，未觀察到雞的死亡。攻毒4 d后解剖所有雞，可見(jiàn)患病雞的腿肌有出血點(diǎn)，法氏囊出現(xiàn)不同程度的腫大，表面有黃色膠凍樣滲出物。攻毒保護(hù)結(jié)果顯示(表1)，抗原組均可以在一定程度上保護(hù)機(jī)體不受IBDV的攻擊，且VP2加佐劑組比不加佐劑組產(chǎn)生更高的保護(hù)率，可達(dá)到80%。

圖7 免疫雞的血清抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Serum antibody test results of immunized chicken

表1 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of the Challenge protection test

2.6 法氏囊病理組織學(xué)觀察

通過(guò)組織病理學(xué)評(píng)價(jià)制備的疫苗對(duì)法氏囊的保護(hù)效果(表1、圖8)，VP2加佐劑組有8只雞的法氏囊組織無(wú)損傷，有長(zhǎng)而厚的黏膜褶，黏膜由大量多面形濾泡構(gòu)成(圖8A)，而VP2組僅有4只法氏囊組織無(wú)損傷，兩組發(fā)病雞的法氏囊主要表現(xiàn)為部分濾泡壞死程度較輕及周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)(圖8B)。攻毒組的雞法氏囊嚴(yán)重壞死，濾泡細(xì)胞基本壞死，且濾泡結(jié)構(gòu)消失，周?chē)梢?jiàn)較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖8C)。未攻毒組中未出現(xiàn)法氏囊組織損傷(圖8D)。

A:VP2加佐劑組;B:VP2組;C:攻毒組;D:未攻毒組

3 結(jié)論與討論

IBDV是嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)的一種病毒。VP2蛋白是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白和宿主保護(hù)性抗原，一直是研究IBDV亞單位疫苗的靶蛋白。目前，VP2蛋白已經(jīng)在多種表達(dá)系統(tǒng)中得到表達(dá)。其中，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的IBDV VP2的亞單位疫苗已經(jīng)應(yīng)用于臨床[19]。因此，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在IBDV亞單位疫苗的研制中具有重要優(yōu)勢(shì)。本研究將構(gòu)建好的pET28a-VP2的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，成功表達(dá)了VP2蛋白，經(jīng)AGP檢測(cè)，表達(dá)的目的蛋白可以與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性抗體反應(yīng)形成沉淀線(xiàn)，表明其具有良好的反應(yīng)原性。此外，VP2蛋白表達(dá)量較低，推測(cè)與表達(dá)菌株有關(guān)。

相比較于親和層析、凝膠過(guò)濾、梯度離心等純化方法，飽和硫酸銨與離子交換層析具有成本低、操作簡(jiǎn)單、可純化大批量蛋白質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，所以本試驗(yàn)首先選用飽和硫酸銨溶液對(duì)VP2蛋白進(jìn)行純化。表達(dá)的目的蛋白經(jīng)飽和硫酸銨溶液沉淀，可以除去部分雜蛋白質(zhì)，沉淀經(jīng)緩沖液充分溶解后，可使蛋白質(zhì)恢復(fù)原來(lái)的特性，這是由于鹽析的過(guò)程是可逆的，基本不會(huì)影響蛋白質(zhì)的活性。之后再經(jīng)離子交換層析進(jìn)行純化，并對(duì)純化條件進(jìn)行優(yōu)化，DEAE為弱陰離子層析，Q為強(qiáng)陰離子層析。其中強(qiáng)陰離子層析的純化效果比弱陰離子層析好，可有效地去除大部分雜蛋白質(zhì)，這可能是由于強(qiáng)陰離子交換填料可以更有效的結(jié)合雜蛋白，從而使目的蛋白先被洗脫。此外，在一定范圍內(nèi)，緩沖液偏堿性比偏酸性的純化效果好，其純度可高達(dá)80%。經(jīng)純化的目的蛋白產(chǎn)量可達(dá)3.4 mg/L，高于之前利用親和層析純化得到的VP2[20]。此純化方法可用于工業(yè)制備VP2蛋白。

在本試驗(yàn)中， VP2蛋白免疫組均產(chǎn)生了特異性抗體。MontanideTMISA 71 VG是一種以礦物油為基礎(chǔ)的佐劑，安全有效，可有效增強(qiáng)體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答[21]。本試驗(yàn)將純化的VP2蛋白與MontanideTMISA 71 VG佐劑混合制備成亞單位疫苗進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，加佐劑的VP2組較不加佐劑的VP2組產(chǎn)生抗體時(shí)間早，且產(chǎn)生的抗體滴度高，可有效地保護(hù)法氏囊組織。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，VP2蛋白可以刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，并在一定程度上保護(hù)雞不受強(qiáng)毒株的攻擊，表明VP2蛋白具有良好的免疫效果。

綜上，應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)VP2蛋白，采用簡(jiǎn)便、低成本的純化方法獲得純度較高且免疫原性良好的目的蛋白，為進(jìn)一步研究IBD亞單位疫苗和建立IBDV檢測(cè)方法提供參考。