雷世成，盧建雄

（1.蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

胰島素(insulin)是由生物體胰臟內(nèi)的胰島細(xì)胞所分泌的一種對脂肪細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用的蛋白激素，同時(shí)能夠?qū)Φ鞍住⑻窃?、脂肪等生物大分子的合成具有促進(jìn)作用。外源性胰島素主要在臨床上用于治療糖尿病。低濃度的胰島素它能促進(jìn)脂類合成并且也有支持其他藥物的脂肪積聚作用[1]。胰島素是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的重要激素之一，在機(jī)體代謝中起重要作用。胰島素能調(diào)節(jié)能量平衡，調(diào)控脂肪細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成和脂質(zhì)代謝等，從而影響脂肪細(xì)胞的生長[1，2]。在一定濃度范圍內(nèi)胰島素敏感性增加能夠正向加速脂肪細(xì)胞的分化過程[3，4]。根據(jù) Flores 等[5]的定義，細(xì)胞分化（differentiation）是指同一來源的細(xì)胞逐漸產(chǎn)生形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能上有差異的細(xì)胞群體。脂肪細(xì)胞分化由脂肪母細(xì)胞、前體脂肪細(xì)胞、不成熟脂肪細(xì)胞到成熟脂肪細(xì)胞的過程[6]。但是目前在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域?qū)Ω杉?xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的機(jī)理還不太清楚，而對前體脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化機(jī)理的研究的比較深入。在體內(nèi)脂肪細(xì)胞是在相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用下激活調(diào)控脂肪細(xì)胞的因子，經(jīng)過一系列復(fù)雜的增殖分化機(jī)制轉(zhuǎn)化為成熟脂肪細(xì)胞[7]。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康的3周齡SD雄性大鼠9只（健康，100 g左右，購自蘭大動(dòng)物醫(yī)學(xué)中心）。該大鼠的采食量一般5 g（100 g體重24 h），溫度在18～26℃，相對濕度40%～70%，通風(fēng)換氣6次/h。

1.2 試驗(yàn)方法

斷頸處死SD大鼠并用75%的酒精消毒處理，在無菌狀態(tài)下取出附睪和腎臟周圍的脂肪組織，除掉毛細(xì)血管和其他結(jié)締組織，用含有雙抗的PBS沖洗2遍并剪碎。剪碎的脂肪組織塊中加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，消化50 min (每隔10 min振蕩1次），然后用孔徑為600目的不銹鋼過篩，1 000 r/min（半徑8 cm）離心10 min，棄上清液，然后用無血清培養(yǎng)液洗2遍，加入含有10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基吹打均勻，即可獲得脂肪細(xì)胞懸液，然后轉(zhuǎn)入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放進(jìn)CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.1 胰島素對大鼠脂肪細(xì)胞增殖活性檢測（MTT法） 培養(yǎng)的大鼠脂肪細(xì)胞密度為5×104/cm2時(shí)接種于96孔培養(yǎng)板當(dāng)中，預(yù)設(shè)胰島素濃度分別為0 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、300 nmol/L、400 nmol/L、500 nmol/L，以0 nmol/L為對照組（不添加任何胰島素），每孔總?cè)莘e為220μl。分別處理2 d、4 d、6 d和8 d進(jìn)行MTT比色測定，記錄光吸收值（A）。

1.2.2 胰島素對油紅O染色提取檢測大鼠脂肪細(xì)胞分化程度 培養(yǎng)的大鼠脂肪細(xì)胞按5×104/cm2的密度接種于24孔培養(yǎng)板，按預(yù)設(shè)濃度加入胰島素稀釋液，每個(gè)濃度需設(shè)3個(gè)重復(fù)增加數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率，每孔容積為4μl，每2 d換1次培養(yǎng)液，在第6 d將培養(yǎng)板從CO2培養(yǎng)箱中取出，倒掉其培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，用10%的甲醛溶液固定1 h，PBS溶液沖洗3次，油紅O染液染色60 min，移除油紅O染液，再用PBS沖洗3次，100%異丙醇萃取油紅O染液，用酶聯(lián)檢測儀分析，記錄光吸收值（A）。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS21統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析與顯著性檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰島素對大鼠脂肪細(xì)胞生長活性的影響

在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)3 d的脂肪細(xì)胞形狀和變化，正常培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞第3 d呈梭形或不規(guī)則三角形(如圖1)，添加低濃度胰島素培養(yǎng)3 d脂肪細(xì)胞已出現(xiàn)脂滴（如圖2），此時(shí)脂滴數(shù)量多而體積小，隨著時(shí)間的延長，以后脂滴會慢慢開始融合、分化的細(xì)胞也增多，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨向于圓形或類圓形，從而獲得成熟脂肪細(xì)胞的形態(tài)特征。

圖1 培養(yǎng)3 d的脂肪細(xì)胞生長形態(tài)(200×)

圖2 添加低濃度胰島素培養(yǎng)3 d脂肪細(xì)胞生長形態(tài)（200×）

2.2 胰島素對大鼠脂肪細(xì)胞增殖的影響（MTT法）

檢測培養(yǎng)的大鼠脂肪細(xì)胞密度為5×104/cm2時(shí)接種于96孔培養(yǎng)板當(dāng)中，按預(yù)設(shè)添加不同濃度胰島素，每個(gè)濃度需設(shè)3個(gè)重復(fù)增加數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率，以0 nmol/L為對照組（不添加任何胰島素），每孔總?cè)莘e為220μl。分別處理2 d、4 d、6 d和8 d進(jìn)行MTT比色測定，記錄光吸收值（A），結(jié)果如表1所示。

結(jié)果表明與對照組相比，胰島素濃度在100～400 nmol/L范圍時(shí)，胰島素促進(jìn)大鼠脂肪細(xì)胞增殖差異顯著，胰島素濃度在300 mmol/L時(shí)大鼠脂肪細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)。隨著胰島素濃度升高到500 nmol/L時(shí)，對脂肪細(xì)胞的增殖作用減弱，并且只在第4～6 d差異顯著，以后差異不顯著，這就驗(yàn)證了中低濃度的胰島素能夠促進(jìn)大鼠脂肪細(xì)胞的增殖。

表1 MTT檢測結(jié)果

2.3 胰島素對大鼠脂肪細(xì)胞分化的影響（油紅O染色）

在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)5 d的脂肪細(xì)胞形狀和變化，正常培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞第5 d呈梭形或不規(guī)則三角形慢慢地分化為少量的脂滴(如圖3)，添加低濃度胰島素培養(yǎng)5 d脂肪細(xì)胞已出現(xiàn)大量的脂滴（如圖4），隨著時(shí)間的延長，以后脂滴會慢慢開始融合，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨向于圓形或類圓形的大脂滴，從而獲得成熟脂肪細(xì)胞的形態(tài)和特征。

圖3 培養(yǎng)5 d的脂肪細(xì)胞油紅染色（200×）

圖4 添加低濃度胰島素培養(yǎng)5 d的脂肪細(xì)胞油紅染色（200×）

2.4 胰島素對油紅O染色提取檢測大鼠脂肪細(xì)胞的分化程度

檢測培養(yǎng)的大鼠脂肪細(xì)胞按5×104/cm2的密度接種于24孔培養(yǎng)板，按預(yù)設(shè)濃度加入胰島素稀釋液，以0 nmol/L為對照組（不添加任何胰島素），每個(gè)濃度需設(shè)3個(gè)重復(fù)增加數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率，油紅O染液染色60 min，移除油紅O染液，再用PBS沖洗，然后用100%異丙醇萃取油紅O染液，用酶聯(lián)檢測儀分析，記錄光吸收值（A），結(jié)果如表2所示。

表2 油紅O染色檢測分化程度

試驗(yàn)分析表明，與對照組相比，胰島素濃度在200～400 nmol/L時(shí)，大鼠脂肪細(xì)胞分化有顯著的促進(jìn)作用；當(dāng)胰島素濃度在500 nmol/L時(shí)脂肪細(xì)胞分化能力最強(qiáng)，這就說明高濃度的胰島素能促進(jìn)大鼠脂肪細(xì)胞的分化。

3 結(jié)論

在脂肪細(xì)胞形成過程中，當(dāng)胰島素的濃度在300～400 nmol/L脂肪細(xì)胞的增殖能力較強(qiáng)，500 nmol/L脂肪細(xì)胞的分化作用最強(qiáng)，這是因?yàn)橐葝u素通過與受體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)生成與降解的酶有關(guān)。通過試驗(yàn)分析說明中低濃度的胰島素可促進(jìn)脂肪組織的合成，高濃度可誘發(fā)脂肪組織的分解。從而也證實(shí)了胰島素是重要的大鼠脂肪細(xì)胞增殖分化的蛋白激素。為進(jìn)一步研究脂肪細(xì)胞增殖分化的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（ChREBP）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP-1c）和乙酰輔酶A脫羧酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)調(diào)控關(guān)系奠定基礎(chǔ)，為臨床上肥胖病和糖尿病發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究和治療效果提供保障。