佘海瑞，賀雪麗

（1.甘肅省肅南裕固族自治縣康樂(lè)鎮(zhèn)農(nóng)牧技術(shù)服務(wù)站，甘肅 肅南 734400；2.甘肅省肅南裕固族自治縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 肅南 734400）

1 發(fā)病情況

肅南縣康樂(lè)鎮(zhèn)賽鼎村張某飼養(yǎng)高山細(xì)毛羊185只，截至2020年4月15日產(chǎn)羔80只，4月8日開(kāi)始羔羊發(fā)病，發(fā)病羔羊年齡段不一（3～20日齡），且均為膘好母羊所產(chǎn)的體格大強(qiáng)健羔羊，到4月15日，發(fā)病31只，死亡20只。

2 臨床癥狀

病初體溫升高到42℃，精神委頓，結(jié)膜潮紅，呼吸困難，四肢僵硬，運(yùn)步失調(diào)或跛行繼而臥地不起，食欲不振、發(fā)抖，口流清涎。未經(jīng)治療的病羔羊多數(shù)在發(fā)病后24 h內(nèi)死亡。經(jīng)治療的病羔羊跛行稍好轉(zhuǎn)，停藥即復(fù)發(fā)，2～3 d治療無(wú)效死亡。

3 剖檢變化

肝臟及膽囊腫大，肝呈黑紫色，腎臟有出血點(diǎn)，質(zhì)地?zé)o明顯變化。腹水增多，并具有惡臭味，其他器官無(wú)病變。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷

4.1 涂片觀察

剪取肝、腎、淋巴結(jié)組織樣品和腸內(nèi)容物做涂片，然后對(duì)涂片進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察。

4.2 細(xì)菌分離及鑒別培養(yǎng)

將肝、脾、肺、腎組織，在生物安全柜內(nèi)表面消毒（過(guò)火焰）、十字切口后從內(nèi)部組織剪取約1 g（黃豆大?。┙M織分別直接接種在TSA 培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基上，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果，并進(jìn)行細(xì)菌純化。將分離、純化的待檢菌分別接種麥康凱瓊脂, SS瓊脂上，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。

4.3 藥敏實(shí)驗(yàn)

挑取單菌落接種于4.5 mlTSB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16 h。用無(wú)菌生理鹽水將培養(yǎng)好的菌液做1：20稀釋，制成均勻懸液。經(jīng)與濁度管（0.5 麥?zhǔn)蠁挝槐葷峁埽┍容^，濁度一致。取100 ul稀釋過(guò)的菌液用涂菌棒均勻地涂于TSA培養(yǎng)基表面。平板放置于37℃ 3～5 min 后，用無(wú)菌鑷子取藥敏紙片，貼于一平板表面，并輕壓一下紙片，使其貼平。每張紙片間距不少于24 mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15 mm。孵育：貼好紙片后在15 min 內(nèi)放到37℃孵育箱，將平板倒置培養(yǎng)。平板孵育16～18 h后取出。

培養(yǎng)后取出平板，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見(jiàn)不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限。用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈的直徑，并判定試驗(yàn)結(jié)果。

4.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攻毒試驗(yàn)

挑取單菌落接種于4.5 ml TSB 培養(yǎng)基中，37℃ 培養(yǎng)16 h。取0.2 ml/只，腹腔注射3只普通級(jí)昆明小鼠，另用3只作為對(duì)照，注射0.2 ml的TSB培養(yǎng)基。觀察并記錄小鼠的臨床表現(xiàn)及死亡情況。

4.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序，BLAST 分析

用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒DNA，細(xì)菌16 SRNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增、電泳后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像，觀察結(jié)果后直接用PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序，BLAST 分析。

用大腸桿菌特異性引物uidAF/uidAR對(duì)上述樣品DNA再次進(jìn)行PCR檢測(cè)。

4.6 實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果

4.6.1 涂片觀察 從肝、腎、淋巴結(jié)、腸內(nèi)容物涂片中明顯觀察到菌體（見(jiàn)圖1），初步判定為大腸桿菌。

圖1 組織涂片革蘭氏染色（100倍）

4.6.2 培養(yǎng)菌落形態(tài)及特性 其中使用肝、脾、肺組織劃線的培養(yǎng)基有菌落生長(zhǎng)，其余組織無(wú)菌落生長(zhǎng)。TSA 培養(yǎng)基平板上形成隆起、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、半透明的灰白色菌落；血瓊脂平板上不溶血；SS 瓊脂、麥康凱瓊脂上形成粉紅色菌落。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢可見(jiàn)中等大小的革蘭氏陰性球桿菌, 兩端鈍圓。

4.6.3 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 藥敏試驗(yàn)

4.6.4 動(dòng)物攻毒試驗(yàn)結(jié)果 在注射18 h后3只實(shí)驗(yàn)組小鼠全部死亡，對(duì)照組無(wú)反應(yīng)。無(wú)菌采取死亡小鼠肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定, 分離出與病原菌一致的細(xì)菌。

4.6.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序及BLAST 分析 結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 BLAST分析結(jié)果為大腸埃希氏菌

4.6.6 大腸桿菌桿菌特異性引物PCR檢測(cè) 結(jié)果（見(jiàn)圖3）。

圖3 PCR結(jié)果圖

4.6.7 實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)論 分離的培養(yǎng)物經(jīng)菌落、菌體形態(tài)觀察、藥敏試驗(yàn)、動(dòng)物攻毒試驗(yàn)和PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序后BLAST 分析、大腸桿菌桿菌特異性引物PCR檢測(cè)，確診為致病性大腸桿菌。

5 防治

5.1 預(yù)防措施

5.1.1 注意羊圈、環(huán)境及用具的消毒 每年的產(chǎn)羔前兩周至產(chǎn)羔結(jié)束，期間要每隔一周進(jìn)行徹底消毒。地面、墻面噴霧消毒后密閉，熏蒸消毒。產(chǎn)羔期及時(shí)進(jìn)行圈舍及環(huán)境中的胎衣的清理工作，每天噴霧消毒1次，消毒藥物替換使用。常用消毒藥物如強(qiáng)力消毒靈、84消毒劑等。

5.1.2 加強(qiáng)懷孕母羊飼養(yǎng)管理 注意補(bǔ)飼，采用全價(jià)飼料和多種飼草飼喂，避免營(yíng)養(yǎng)缺乏。

5.1.3 搞好初生羔羊的護(hù)理 注意保暖，保證吃到初乳，對(duì)剛出生的羔羊及時(shí)扎臍并用5%碘酊進(jìn)行臍帶浸泡消毒。

5.1.4 對(duì)新生羔羊全部進(jìn)行藥物預(yù)防 在羔羊出生1～2d內(nèi)用土霉素片粉或多西環(huán)素2 g 用適量煉制豬油(約1 cm3)拌勻后，吞服，每天1次，連用3d，或用慶大霉素在羔羊出生1 d后2ml進(jìn)行灌服，連用3 d。

5.2 治療措施

5.2.1 及時(shí)隔離病羔，加強(qiáng)圈舍及環(huán)境的衛(wèi)生清理和消毒，對(duì)病死羔羊采取嚴(yán)格的無(wú)害化處理措施。

5.2.2 對(duì)病羔羊進(jìn)行藥物治療：頭孢曲松或頭孢噻肟0.1g配用注射用水肌注，每天1次，連用3 d。對(duì)有關(guān)節(jié)癥狀或發(fā)熱嚴(yán)重者的用頭孢曲松或頭孢噻肟0.1g配用2 ml地塞米松磷酸鈉、安痛定3 ml肌注。

5.2.3 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，懷孕母羊和產(chǎn)羔母羊及時(shí)分群。

5.2.4 對(duì)羔羊進(jìn)行全群藥物預(yù)防，按5.1.4辦法進(jìn)行，可適當(dāng)加大預(yù)防劑量。

5.2.5 母羊產(chǎn)羔后及時(shí)用0.1%的高錳酸鉀水擦拭母羊的乳房、乳頭和腹下。

6 討論

大腸桿菌菌為條件性致病菌，本病的發(fā)生與當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件和飼養(yǎng)管理有一定的關(guān)系。當(dāng)?shù)馗拭C高山細(xì)毛母羊每年10月底配種，來(lái)年3月底開(kāi)始產(chǎn)羔，母羊懷孕的大部分時(shí)期及產(chǎn)羔期是枯草期，當(dāng)?shù)貧夂驐l件寒冷，母羊懷孕和產(chǎn)羔期氣候寒冷多變，傳統(tǒng)的放養(yǎng)方式中母羊人工補(bǔ)飼時(shí)間短，且飼草品種單一，導(dǎo)致母羊營(yíng)養(yǎng)缺乏，加之氣候多變使羔羊的抵抗力降低是該病發(fā)生的重要誘因。

對(duì)母羊或羔羊使用疫苗來(lái)預(yù)防該病，筆者并不贊同使用疫苗，首先是大腸桿菌血清型多，其次是羔羊往往還來(lái)不及產(chǎn)生抗體就已經(jīng)發(fā)病死亡。所以對(duì)于該病的預(yù)防重在飼養(yǎng)管理。