葉桐桐，龍琴琴，李洪珊，柳佳佳，姚一凡，龔賽賽，楊 琨

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730100）

牦牛主要分布在我國青藏高原及其周邊的高原地區(qū)，是當(dāng)?shù)啬羺^(qū)的特產(chǎn)動(dòng)物。其生活環(huán)境較為寒冷且含氧量極低，因此，牦牛的生長繁殖有高原適應(yīng)性并且會(huì)隨著季節(jié)的變化而變化[1]。促性腺激素釋放激素是一種由下丘腦分泌的神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過下丘腦—垂體—門循環(huán)進(jìn)入垂體前葉，刺激促黃體素（LH）和促卵泡激素（FSH）的分泌，其中LH可以促進(jìn)睪酮的生成，F(xiàn)SH可以促進(jìn)精子的生成，對睪丸的生理過程和牦牛的生長繁殖階段起關(guān)鍵性作用[2]。此外，GnRH及其受體還廣泛存在于垂體軸之外的生殖組織之中，如卵巢、子宮、前列腺等，可見其對于動(dòng)物體的生殖繁衍有著舉足輕重的作用。本研究是采用免疫組化SP染色方法檢測GnRH在牦牛睪丸不同細(xì)胞中的分布特征，為深入闡明GnRH在睪丸中的作用機(jī)理提供理論依據(jù)，并對提高GnRH在牦牛的生長繁殖的應(yīng)用提供理論資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

3頭健康成年雄性牦牛的睪丸組織采于甘肅省臨夏回族自治州某屠宰場，并用4%多聚甲醛固定。

1.2 試劑與儀器

試劑主要有購自北京博奧森技術(shù)有限公司的兔GnRH多克隆抗體（bs-10369R）免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（sp-0023），購自北京索萊寶科技有限公司的DAB濃縮型顯色試劑盒；儀器設(shè)備主要有病理組織切片機(jī)、顯微鏡照相系統(tǒng)等。

1.3 HE染色及免疫組化SP染色

1.3.1 取材與固定 試驗(yàn)動(dòng)物采用頸動(dòng)脈放血的方式致死，后迅速將睪丸組織取出，將外層白膜玻璃后迅速放入4%多聚甲醛中固定12 h后更換新的固定液存放。

1.3.2 HE染色 石蠟切片（5μm）經(jīng)酒精脫蠟至水后；蘇木精染核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)后經(jīng)酒精分化，隨后脫水、透明、封片即可。

1.3.3 免疫組化SP染色 石蠟切片（5μm）經(jīng)酒精脫蠟至水后，蒸餾水和PBS分別浸泡5 min；經(jīng)抗原修復(fù)（檸檬酸鹽緩沖液-微波熱修復(fù)法）、阻斷、封閉后滴加一抗工作液孵育（37℃濕盒中）；隨后二抗、三抗反應(yīng)后，滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察適度停止反應(yīng)；隨后用蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化，脫水、透明、封片即可。

其中，阻斷用液、封閉用液、二抗和三抗工作液來自免疫組化SP試劑盒；一抗來自兔GnRH多克隆抗體（工作濃度1：400）。

1.3.4 圖像采集與結(jié)果判定 經(jīng)免疫組化染色后的切片，強(qiáng)陽性表達(dá)呈較深棕黃色，陽性表達(dá)顏色次之，弱陽性表達(dá)顏色次于陽性但深于背景色，陰性對照無顏色表達(dá)或與背景色相似。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛睪丸組織學(xué)構(gòu)造（HE染色×100）

圖1所示，可見許多生精小管橫斷面，其管壁由大量細(xì)胞組成，主要為生精細(xì)胞和支持細(xì)胞。生精細(xì)胞由上皮深部到淺部增殖分化，最深層一般為精原細(xì)胞，從青春期便開始增殖分化為初級精母細(xì)胞。再通過細(xì)胞分裂為次級精母細(xì)胞，最終經(jīng)過演變分化在上皮淺部生成精子。支持細(xì)胞能夠推動(dòng)生精細(xì)胞移向管腔。生精小管之間的疏松結(jié)締組織中分布著大量的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，具有分泌雄激素類固醇的作用。

圖1 牦牛睪丸HE染色結(jié)果

2.2 促性腺激素釋放激素在牦牛睪丸中的定位（免疫組化SP染色×100）

如圖2所示，睪丸組織中的生精小管的生精細(xì)胞的胞質(zhì)和疏松結(jié)締組織中的睪丸間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中可見深棕黃色到黃色的陽性表達(dá)。并且與圖3相比，后者無著色呈陰性，說明試驗(yàn)結(jié)果具有特異性，結(jié)論可靠。最終可從圖2中得到，GnRH陽性物質(zhì)主要分布于睪丸的生精細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞之中，尤其在生精細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)。

圖2 牦牛睪丸免疫組化染色結(jié)果

圖3 牦牛睪丸免疫組化陰性對照

3 結(jié)論與討論

由試驗(yàn)結(jié)果可得，GnRH在牦牛睪丸間質(zhì)細(xì)胞和生精細(xì)胞中均可見陽性表達(dá)，在生精細(xì)胞中呈強(qiáng)表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)稍次之。由此說明其與牦牛的生殖功能一定有所關(guān)聯(lián)，一是GnRH通過下丘腦—垂體—性腺軸刺激LH和FSH的分泌，從而促進(jìn)睪酮和精子的生成；二是GnRH及其受體廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體其他組織之中，如前列腺、子宮、卵巢等，并在其中通過旁分泌或自分泌的方式在局部調(diào)節(jié)生殖激素[3，4]。

GnRH、LH、FSH是睪丸實(shí)現(xiàn)生殖功能，機(jī)體實(shí)現(xiàn)生長繁殖中不可或缺的3種調(diào)節(jié)因子，GnRH經(jīng)由下丘腦—垂體—性腺軸這一過程，刺激LH和FSH的分泌。其中LH主要作用于睪丸間質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)其產(chǎn)生睪酮；FSH作用于生精細(xì)胞和支持細(xì)胞，從而影響精子的產(chǎn)生和激素的分泌。相反地，如果動(dòng)物機(jī)體遭遇外界因素或自身機(jī)能衰退的影響，導(dǎo)致睪丸病變或損傷，間質(zhì)細(xì)胞萎縮，則會(huì)引起機(jī)體激素分泌異常，從而反饋性的抑制垂體和下丘腦的功能，以減弱其分泌LH和FSH的能力。LH產(chǎn)生的睪酮可以刺激生殖器官的發(fā)育、精子的發(fā)生和骨質(zhì)生成等，并且對雄性第二性征和性成熟有不可替代的作用。而FSH也能與LH配合使卵泡內(nèi)膜細(xì)胞分泌雄激素[5-8]。與此同時(shí)，GnRH還表現(xiàn)出與人體絨毛膜促性腺激素相似的功能，如促進(jìn)精子活力、增強(qiáng)精液品質(zhì)[9]。對于雄性動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物而言，生理濃度的GnRH與LH有極其相似的作用并且在臨床試驗(yàn)中不具有種族特異性，與機(jī)體不產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，但在臨床應(yīng)用中的具體方案還需進(jìn)一步試驗(yàn)確定[10,11]。

GnRH在動(dòng)物體內(nèi)的作用會(huì)根據(jù)它所處組織不同而不同。有研究表明：下丘腦中的GnRH可調(diào)控促性腺激素的釋放；胎盤中的GnRH可調(diào)控人體絨毛促性腺激素的分泌；腫瘤中的GnRH可調(diào)控癌細(xì)胞的增殖等。而在生殖系統(tǒng)中，GnRH及其受體可通過旁分泌或自分泌的方式，在局部調(diào)節(jié)血漿促性腺激素和類固醇激素的水平，從而影響動(dòng)物體的生殖功能[12]。本研究通過定位GnRH在牦牛睪丸組織中的分布，主要在睪丸生精細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中，且在生精細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)，間質(zhì)細(xì)胞次之的結(jié)論，為完善充實(shí)以上調(diào)節(jié)機(jī)制提供了更新的理論依據(jù)。