趙園園 孟金柱

摘要：表皮內(nèi)干細(xì)胞因子（stem cell factor，簡稱SCF）是由角化細(xì)胞合成并分泌到細(xì)胞間隙，參與黑色素細(xì)胞存活、增殖和黑色素生成。為確定黑色素細(xì)胞能否合成SCF，分離培養(yǎng)綿羊的皮膚黑色素細(xì)胞，并運(yùn)用免疫熒光技術(shù)對(duì)黑色素細(xì)胞內(nèi)SCF進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞特征明顯，且在黑色素細(xì)胞中檢測(cè)到存在SCF蛋白。據(jù)此可以推測(cè)黑色素細(xì)胞也能合成SCF，它在黑色素細(xì)胞存活、增殖和黑色素生成中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：綿羊;黑色素;形態(tài)特征;干細(xì)胞因子（SCF）;表達(dá)定位

中圖分類號(hào)：S826.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）16-0079-03

干細(xì)胞因子（stem cell factor，簡稱SCF）又被稱為肥大細(xì)胞因子或c-kit配體，是一種膜錨定的非共價(jià)結(jié)合二聚體，通過與c-kit受體結(jié)合進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和肥大細(xì)胞遷移、存活和增殖所必需的[1]。SCF mRNA通過選擇性剪接形成2個(gè)不同的跨膜前體，可對(duì)細(xì)胞表面蛋白酶的敏感性進(jìn)行區(qū)分。較大的剪接變異體（SCF-M1）包含1個(gè)蛋白水解位點(diǎn)，可迅速產(chǎn)生可溶性SCF蛋白（S-SCF），而較小的剪接變異體（SCF-M2）缺乏這個(gè)蛋白水解位點(diǎn)，可形成膜結(jié)合形式SCF蛋白（M-SCF）。然而，較小的剪接變異體的替代水解位點(diǎn)也會(huì)被加工，但效率很低。S-SCF調(diào)控黑色素前體細(xì)胞的遷移，相對(duì)地，M-SCF向表皮的黑色素細(xì)胞傳遞導(dǎo)向、存活和增殖信號(hào)[2]。

先前的研究表明，表皮SCF是由角化細(xì)胞衍生形成的，通過與黑色素細(xì)胞膜上的c-kit結(jié)合影響黑色素細(xì)胞的存活、遷移和增殖以及黑色素合成[3]。為明確SCF在黑色素細(xì)胞中的表達(dá)部位，本研究分離培養(yǎng)綿羊黑色素細(xì)胞，并用免疫熒光對(duì)綿羊皮膚黑色素細(xì)胞中的SCF蛋白的表達(dá)進(jìn)行定位研究，以期為進(jìn)一步研究其在黑色素細(xì)胞存活、增殖及色素生成中的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)以1歲齡黑白花綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，用取皮器取黑色皮膚（直徑約1 mm）進(jìn)行黑色素細(xì)胞的分離。

1.2 皮膚黑色素細(xì)胞的分離培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)中，將綿羊皮膚放入75%酒精中浸泡約10 min，用含雙抗（青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 IU/mL）的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗3～5次，將皮膚組織剪成2 mm×2 mm的小塊，真皮朝下放入無菌培養(yǎng)皿中，加入0.05% Dispase Ⅱ酶 10 mL，4 ℃下消化16 h，采用眼科鑷分離開真皮和表皮，將表皮放入0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中，室溫下孵育5 min，隨后加入等體積含10% FBS的培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)箱中（含5% CO2）孵育1 h，反復(fù)吹打，形成黑色素細(xì)胞懸液，采用200目細(xì)胞篩進(jìn)行過濾，收集過濾液，低速冷凍離心（1 000 r/min，4 ℃），棄上清，加入 2 mL 含雙抗和生長因子的MELM（ScienCell）培養(yǎng)基，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/mL，轉(zhuǎn)移至六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入 1 mL 細(xì)胞懸液，再加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)基，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng) 48 h，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至約80%進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化。

1.3 免疫熒光

對(duì)濃度達(dá)到約80%的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將其轉(zhuǎn)移至鋪有蓋玻片的細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至濃度約為80%時(shí)，去掉培養(yǎng)基，用PBS洗3次。取出附著有細(xì)胞的蓋玻片，注意不要觸碰到細(xì)胞，加入4%多聚甲醛冰上固定 15 min，用PBS洗3次，每次3 min，往載玻片上滴加0.5% Triton X-100，以覆蓋全部細(xì)胞為宜，室溫孵育20 min，用PBS洗3次，每次3 min，滴加山羊血清，室溫封閉30 min，用PBS洗3次，滴加SCF抗體（一抗，ab64677，abcam，1 ∶ 200 稀釋）稀釋液，以滴加PBS為對(duì)照組，放入溫盒中，4 ℃過夜孵育第2天取出，在室溫下復(fù)溫 30 min，用PBST（PBS溶液加Tween-20）洗3次，每次3 min，滴加鏈霉素和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物-異硫氰酸熒光素（SABC-FITC）（山羊IgG）（熒光二抗，1 ∶ 100，博士德）37 ℃孵育1 h，用PBST洗3次，吸干水，用抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡藍(lán)光激發(fā)熒光下觀察、采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊皮膚黑色素細(xì)胞的形態(tài)特征觀察

對(duì)分離培養(yǎng)的第3代綿羊黑色素細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)，綿羊黑色素細(xì)胞生長較快，排列緊密，呈鵝卵石狀排列，細(xì)胞有突起，突起數(shù)量為1～3個(gè)，細(xì)胞排列密集時(shí)，突起較少，而分布稀疏部位的細(xì)胞突起較多且明顯。

2.2 綿羊皮膚黑色素細(xì)胞中SCF的表達(dá)定位

通過免疫熒光技術(shù)對(duì)綿羊皮膚黑色素細(xì)胞中的SCF蛋白進(jìn)行檢測(cè)，由圖2可知，SCF蛋白可在綿羊黑色素細(xì)胞中表達(dá)，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，尤其是細(xì)胞核的周圍。

3 討論

對(duì)黑色素細(xì)胞的分離多采用酶消化法，主要有Dispase Ⅱ酶聯(lián)合胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶獨(dú)立消化法，因胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的損傷作用較明顯，本

研究采用Dispase Ⅱ酶聯(lián)合胰蛋白酶消化法來分離綿羊皮膚的黑色素細(xì)胞。白瑞等發(fā)現(xiàn)，Dispase Ⅱ酶處理組收集的黑素細(xì)胞明顯多于其他組，說明Dispase Ⅱ酶能更好地分離皮膚，并且能更完全地摧毀皮膚的基底層，使黑色素細(xì)胞更完全地暴露出來，便于收集到更多的黑色素細(xì)胞，同時(shí)，由于胰蛋白酶的處理時(shí)間縮短，大大降低了對(duì)細(xì)胞的損傷，使細(xì)胞活性和生長狀態(tài)更好[4]。牛牧采用酶消化法聯(lián)合組織塊法對(duì)人的皮膚黑色素細(xì)胞進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)原代細(xì)胞的數(shù)量雖然稍少，但細(xì)胞樹突較多、交織成網(wǎng)、貼壁良好[5]。本研究獲得的黑色素細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)與先前的研究[6-7]相符合。

SCF/c-kit信號(hào)通路在黑色素細(xì)胞中能誘導(dǎo)小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）和酪氨酸相關(guān)蛋白酶1（TYRP1）的轉(zhuǎn)錄，TYRP1是酪氨酸酶（TYR）家族成員之一，該家族能直接催化黑色素的生成，而MITF通過與該基因家族的啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)其表達(dá)，從而促進(jìn)黑色素合成[8-11]。本研究結(jié)果顯示，SCF在黑色素細(xì)胞中存在，這為研究SCF在黑色素細(xì)胞中的功能提供了新方向。另外，SCF在細(xì)胞核周圍區(qū)域分布豐富，這可能是由于基因在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞質(zhì)中翻譯成蛋白質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究成功分離培養(yǎng)綿羊黑色素細(xì)胞，觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞特征明顯。SCF可在黑色素細(xì)胞中表達(dá)，且集中表達(dá)區(qū)域?yàn)榧?xì)胞核的周圍。

參考文獻(xiàn)：

[1]趙園園. MiR-27a-3p對(duì)黑色素生成的作用及機(jī)制研究[D]. 晉中：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[2]Slominski A，Tobin D J，Shibahara S，et al. Melanin pigmentation in mammalian skin and its hormonal regulation[J]. Physiological Reviews，2004，84（4）：1155-1228.

[3]Shan J，Yu X J，Dong C S. MiR-137 affects melanin synthesis in mouse melanocyte by repressing the expression of c-Kit and Tyrp2 in SCF/c-Kit signaling pathway[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2016，80（11）：2115-2121.

[4]白 瑞，于志慧，楊 剛，等. 不同消化酶對(duì)羊駝皮膚黑素細(xì)胞分離的影響[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（8）：136-138.

[5]牛 牧，李其林，何丹華，等. 酶消化法聯(lián)合組織塊法與經(jīng)典酶消化法體外分離培養(yǎng)黑色素細(xì)胞的比較[J]. 廣東醫(yī)學(xué)，2013，34（4）：501-504.

[6]鮑加榮，劉學(xué)慶，岳志剛，等. 赤狐皮膚黑色素細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，46（8）：1511-1515.

[7]田穎剛，廖春艷，徐德利. 烏骨雞皮膚黑色素細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定[J]. 中國家禽，2014，36（12）：6-10.

[8]Luo D，Chen H，Searles G，et al. Coordinated mRNA expression of c-Kit with tyrosinase and TRP-1 in melanin pigmentation of normal and malignant human melanocytes and transient activation of tyrosinase by Kit/SCF-R[J]. Melanoma Research，1995（5）：303-309.

[9]Wu M，Hemesath T J，Takemoto C M，et al. c-Kit triggers dual phosphorylations，which couple activation and degradation of the essential melanocyte factor mi[J]. Genes & Development，2000，14（3）：301-312.

[10]Bentley N J，Eisen T，Goding C R. Melanocyte-specific expression of the human tyrosinase promoter：activation by the microphthalmia gene product and role of the initiator[J]. Molecular and Cellular Biology，1994，14（12）：7996-8006.

[11]Ken-Ichi Y，Yokoyama K，Takahashi K，et al. Functional analysis of microphthalmia-associated transcription factor in pigment cell-specific transcription of the human tyrosinase family genes[J]. Journal of Biological Chemistry，1997，272（1）：503-509.