黎妍妍，李春黎，王林，彭五星，楊勇，陳守文，李錫宏

1 湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030；

2 湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430070；

3 湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢 430040；

4 恩施州煙草公司 宣恩縣煙葉分公司，恩施 445500

煙草青枯病由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的細(xì)菌性土傳病害，每年給煙葉生產(chǎn)造成巨大損失[1]。經(jīng)過(guò)近年來(lái)綠色防控重大專項(xiàng)的實(shí)施，煙草青枯病的防治主要以生物防治為主。生物防治不僅對(duì)植物具有防病促生的作用，而且能有效克服生產(chǎn)中存在的農(nóng)藥殘留和病菌抗藥性等問(wèn)題[2-3]。利用生防菌是植物病害生物防治的重要手段。目前，生防菌多采用菌液兌水灌根的方式施用[4-5]。然而，由于土壤微生態(tài)環(huán)境的復(fù)雜性[6]，生防菌進(jìn)入土壤后，土壤微生物對(duì)這種外來(lái)“入侵者”會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的排斥作用。由于環(huán)境不適、營(yíng)養(yǎng)不足等原因，施用的生防菌往往無(wú)法定殖，從而不能很好地發(fā)揮其生防功能，致使其抑菌功能和控病作用難以顯現(xiàn)。因此，根據(jù)土壤微生態(tài)原理的營(yíng)養(yǎng)抗性理論，應(yīng)在生防菌的使用等方面加以改進(jìn)[7]。本研究旨在通過(guò)田間小區(qū)試驗(yàn)和擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，探究生防菌劑不同使用方式對(duì)煙草青枯病的防控效果及其對(duì)煙株根際土壤細(xì)菌群落的影響，以期為進(jìn)一步提升生防菌的防控效果提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

生防菌株（YH-22）[5]為芽孢桿菌，按相關(guān)工藝將其發(fā)醇、干燥成粉劑（1.0×1010CFU/g）；米糠為市場(chǎng)購(gòu)入。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)及試驗(yàn)設(shè)置

2018年在湖北省恩施州宣恩縣（29.97°N，109.38°E）開展該試驗(yàn)。試驗(yàn)地連作15年，青枯病發(fā)生嚴(yán)重。試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理，GG為生防菌兌水灌根，生防菌：水按1∶500混勻后灌根50 mL/株；WG為生防菌拌土圍根，生防菌：土按1: 1000混勻后圍根100 g/株；MK+WG為米糠+生防菌拌土圍根，米糠: 生防菌: 土為60∶1∶940，先將米糠和生防菌混合均勻，噴水后覆膜、發(fā)醇20～25 d，然后拌土圍根100 g/株；CK1為清水灌根50 mL/株；CK2（MK）為米糠拌土圍根，米糠：土按3∶47混勻后圍根100 g/株。隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，每小區(qū)種植烤煙60株，株行距為0.55 m×1.2 m，煙草品種為云煙87。煙葉移栽時(shí)和移栽后40 d各處理各施用一次，每次劑量相同。

1.3 煙草青枯病發(fā)生情況調(diào)查

1.4 煙株根際土壤樣品采集

煙葉移栽后100 d 時(shí)，選取每小區(qū)長(zhǎng)勢(shì)較為一致的5 株煙株，采集根際土壤（與根系結(jié)合較緊密的4 mm 內(nèi)的土壤）樣品。每小區(qū)5 株煙株根際土樣混合形成一個(gè)樣品，共采集15個(gè)土樣。將土樣置于干冰（固態(tài)CO2）中帶回實(shí)驗(yàn)室，放置于-80℃冰箱中保存，以備提取DNA。

1.5 土壤微生物群落分析

1.5.1 DNA 提取及PCR 擴(kuò)增

采 用FastDNA Spin Kit 試 劑 盒（MP Biomedicals, USA） 提 取 土 壤 總DNA。 以515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′） 和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）為引物對(duì)細(xì)菌16S rDNA V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。30 μL 擴(kuò)增體系包括：15 μL Phusion Master Mix Buffer（2×）、3 μL 引物（2 μmol/L）、10 μL DNA（1 ng/μL）模板和2 μL ddH2O。反應(yīng)程序包括：98℃ 1 min；98℃ 10 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s（30 個(gè)循環(huán)）；72℃ 5 min（Bio-rad T100 梯度PCR 儀）。PCR 產(chǎn)物檢測(cè)合格后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，使用Illumina Hiseq PE250測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（由諾禾致源生物信息科技有限公司完成）。

1.5.2 OTU 聚類與物種注釋

以97%的一致性將所有樣品的有效序列聚類為OTUs。對(duì)OTUs 代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用R軟件（V 2.15.3）繪制稀釋曲線圖。利用Qiime 軟件（V 1.9.1）計(jì)算Sobs、Chao1豐富度指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)。在門分類水平上，基于加權(quán)Unifrac距離，利用Qiime軟件（V 1.7.0）對(duì)土壤細(xì)菌群落組成進(jìn)行UPGMA聚類分析。用SPSS 22.0中的One-way ANOVA分析煙草青枯病病情指數(shù)和細(xì)菌群落組成等在各處理間的差異（P＜0.05水平）。根據(jù)屬水平上的物種注釋和豐度信息，對(duì)各樣品的物種豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到Z值，采用HemI軟件（V1.0）繪制Heatmap圖。Z=（a-Av）/SD，其中a為樣品在該分類上的相對(duì)豐度，Av為所有樣品在該分類的平均相對(duì)豐度，SD為所有樣品在該分類上的標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草青枯病發(fā)生情況

煙葉移栽后100 d 對(duì)煙草青枯病發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查與分析。結(jié)果表明，GG、WG 和MK+WG處理煙草青枯病病情指數(shù)均顯著低于CK1，WG 和MK+WG 處理煙草青枯病病情指數(shù)均顯著低于CK2。依據(jù)病情指數(shù)，計(jì)算得GG、WG、MK+WG 和CK2相對(duì)于CK1 的防效分別為49.72%、55.93%、59.32%和36.72%，表明生防菌不同施用方式對(duì)煙草青枯病的防效表現(xiàn)為MK+WG＞W(wǎng)G＞GG（圖1）。

圖1 煙草青枯病發(fā)生情況Fig. 1 The occurrence of tobacco bacterial wilt

2.2 根際土壤測(cè)序深度評(píng)估

以細(xì)菌有效序列數(shù)為橫坐標(biāo)、OTU 數(shù)量為縱坐標(biāo)的土壤細(xì)菌群落稀釋曲線表明，在97%一致性的OTUs 分類水平下，測(cè)序量增加的初始階段時(shí)OTU數(shù)量急劇上升；之后，OTU 數(shù)量基本趨向于平緩，表明測(cè)序數(shù)量基本合理，可反映土壤細(xì)菌群落絕大多數(shù)序列信息（圖2）。

圖2 根際土壤細(xì)菌群落OTUs 稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curve of bacterial community in rhizosphere soil OTUs

2.3 土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度分析

對(duì)根際土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度進(jìn)行了差異分析。土壤細(xì)菌群落OTU數(shù)量以WG、MK+WG和CK2顯著高于CK1，而與GG間無(wú)顯著差異；Sobs和Shannon指數(shù)在GG、WG、MK+WG和CK2間無(wú)顯著差異，但均顯著高于CK1；Chao1指數(shù)以WG、MK+WG顯著高于CK1，而與GG、CK2無(wú)顯著差異。其中，OTU數(shù)量、Sobs和Shannon指數(shù)均以MK+WG處理最高，分別較其它處理高2.72%～54.04%、2.62%～49.01%和1.23%～21.40%；C h a o 1 指數(shù)以W G 處理最高，較其它處理高0.53%～40.35%（表1）。

表1 土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度分析Tab. 1 The analysis of diversity and richness of soil bacterial community in rhizosphere soil

2.4 門水平上土壤細(xì)菌群落組成分析

2.4.1 土壤主要細(xì)菌門相對(duì)豐度分析

對(duì)相對(duì)豐度排名前1 0 位的土壤細(xì)菌門進(jìn)行了分析。在各處理根際土壤中，變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度最高，占40.26%～50.68%；其它細(xì)菌門分別為放線菌門（Actinobacteria，7.70%～21.64%）、酸桿菌門（Acidobacteria，9.69%～16.76%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，4.8 7%～9.6 6%）、厚壁菌門（F i r m i c u t e s，1.87%～13.62%）、綠彎菌門（Chloroflexi，3.57%～6.74%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，3.04%～5.90%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae，0.41%～2.60%）、 疣微菌門（Verrucomicrobia，1.11%～2.07%）和浮霉菌門（Planctomycetes，1.15%～2.00%）。這10個(gè)細(xì)菌門的相對(duì)豐度共占94.64～97.03%（表2）。

表2 土壤細(xì)菌群落主要門的相對(duì)豐度Tab. 2 The relative abundance of soil bacterial community at major phylum levels

根際土壤中放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度在各處理間存在顯著差異。GG中芽單胞菌門的相對(duì)豐度顯著高于CK1，增加67.56%；酸桿菌門的相對(duì)豐度顯著高于其它處理。WG中放線菌門的相對(duì)豐度顯著高于CK1和CK2，分別增加130.78%和99.66%；芽單胞菌門的相對(duì)豐度顯著高于CK1，增加98.36%。MK+WG中放線菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度均顯著高于CK1和CK2，其中放線菌門分別增加181.04%和143.15%，綠彎菌門分別增加68.50%和88.80%。GG、WG和MK+WG處理中厚壁菌門的相對(duì)豐度均顯著低于CK1，而與CK2無(wú)顯著差異。

2.4.2 門水平上土壤細(xì)菌群落聚類分析

對(duì)各處理根際土壤細(xì)菌群落在門分類水平上進(jìn)行了UPGMA聚類分析。各處理間土壤細(xì)菌群落門水平的組成及豐度差異較為明顯。WG和MK+WG處理相似性較高，聚為一類；GG和CK2相似性較高，聚為一類；CK1單獨(dú)為一類。以上結(jié)果表明WG和MK+WG處理對(duì)煙株根際土壤細(xì)菌群落組成具有較大影響（圖3）。

圖3 土壤細(xì)菌在門分類水平上的UPGMA 聚類樹圖Fig. 3 UPGMA clustering tree diagram of soil bacteria at phyla level

2.5 屬水平上土壤細(xì)菌群落組成分析

對(duì)各處理根際土壤中主要細(xì)菌屬的相對(duì)豐度進(jìn)行了分析。GG、WG、MK+WG和CK1、CK2中相對(duì)豐度＞1%的細(xì)菌屬分別有7、7、7和11、5個(gè)（表3）。對(duì)各處理土壤樣本中這19個(gè)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度相似性繪制了Heatmap圖（圖4），結(jié)果表明，WG和MK+WG處理相似性較高，聚為一類；CK1和CK2相似性較高，聚為一類；GG單獨(dú)為一類。

圖4 屬水平上土壤細(xì)菌豐度聚類熱圖Fig. 4 Heatmap of relative abundance of soil bacteria at genus level

表3 土壤細(xì)菌群落主要屬的相對(duì)豐度Tab. 3 The relative abundance of soil bacteria community at major genus levels

對(duì)這些細(xì)菌屬的相對(duì)豐度在各處理間的差異進(jìn)行了方差分析， 結(jié)果顯示，Mizugakiibacter、Sphingomonas、Proteus、Burkholderia-Paraburkholderia、Gemmatimonas、Pseudarthrobacter、Roseburia、Massilia、Rhodanobacter、Bryobacter、Ramlibacter、Bradyrhizobium和Gaiella的相對(duì)豐度在各處理間存在顯著差異。

與CK1相比，GG處理顯著提高了土壤中Massilia和Gaiella的相對(duì)豐度，降低了Mizugakiibacter、Proteus、Roseburia和Rhodanobacter的相對(duì)豐度；WG和MK+WG處理顯著提高了土壤中Gemmatimonas、Pseudarthrobacter、Ramlibacter、Bradyrhizobium和Gaiella的相對(duì)豐度，降低了Mizugakiibacter、Proteus、Burkholderia-Paraburkholderia、Roseburia和Bryobacter的相對(duì)豐度；此外，WG處理還顯著降低了Rhodanobacter的相對(duì)豐度。與CK2相比，GG處理顯著降低了Sphingomonas的相對(duì)豐度；W G 和M K+W G 均顯著提高了Pseudarthrobacter、Ramlibacter和Gaiella的相對(duì)豐度，而降低了Sphingomonas和Burkholderia-Paraburkholderia的相對(duì)豐度；此外，WG處理還顯著提高了Gemmatimonas的相對(duì)豐度，MK+WG處理還顯著提高了Bradyrhizobium的相對(duì)豐度。

3 討論

生防菌在防治作物青枯病中的研究與應(yīng)用已有較多報(bào)道。研究表明，生防菌的防效通常受生防菌、病原菌、植株和環(huán)境等多方面的影響[8]。這些方面相互作用，造成根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而影響煙草青枯病的發(fā)生與流行。因此，分析生防菌的使用對(duì)土壤微生物群落的影響，對(duì)于探明生防菌防控青枯病的機(jī)理，改進(jìn)并探尋合適的使用方式具有重要意義。

本研究在進(jìn)行煙草青枯病發(fā)病情況調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是與CK1（清水灌根）相比較，還是與CK2（米糠圍根）相比較，生防菌拌土圍根、米糠+生防菌拌土圍根的使用方式均能顯著降低煙草青枯病的病情指數(shù)，而這兩者之間并無(wú)顯著差異，表明對(duì)煙草青枯病起主要防控作用的是生防菌。有研究指出可以通過(guò)改進(jìn)生防菌的使用方法來(lái)提升生防菌的拮抗效果[7]，添加一些載體材料可以提高生防菌的定殖能力和有效性[11-12]。本研究中添加的米糠和生防菌發(fā)醇可能有助于促進(jìn)兩者融合，使米糠為生防菌提供空間保護(hù)，更有利于生防菌在土壤環(huán)境中定殖；同時(shí)，米糠中富含的豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、多種維生素和礦物質(zhì)等，可作為營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)為生防菌提供持續(xù)的營(yíng)養(yǎng)，從而使生防菌在營(yíng)養(yǎng)上處于優(yōu)勢(shì)。

一般來(lái)說(shuō)，微生物群落多樣性和豐富度指數(shù)越高，其響應(yīng)各種脅迫的修復(fù)能力也越強(qiáng)[9]。與青枯病發(fā)病煙田相比，健康煙田煙株根際土壤具有較高的微生物群落多樣性和豐富度[10]。本研究結(jié)果顯示，生防菌拌土圍根、米糠+生防菌拌土圍根較生防菌兌水灌根更能明顯提高煙株根際土壤細(xì)菌群落的Sobs、Shannon和Chao1等多樣性和豐富度指數(shù)，其中尤以米糠+生防菌拌土圍根的提升效果顯著，表明米糠+生防菌拌土圍根更能提高煙株根際土壤細(xì)菌群落的修復(fù)能力，從而更好地保護(hù)煙株免受青枯菌的侵染。

從根際土壤細(xì)菌群落組成結(jié)果可以看出，具有拮抗作用或促生作用的細(xì)菌門的相對(duì)豐度在施用生防菌后發(fā)生了顯著變化。生防菌兌水灌根和生防菌拌土圍根顯著提高了土壤中芽單孢菌門、生防菌拌土圍根和米糠+生防菌拌土圍根顯著提高了土壤中放線菌門的相對(duì)豐度，這些細(xì)菌可能產(chǎn)生更多的抗生素或其它次生代謝產(chǎn)物來(lái)抑制土傳病原菌的定殖，從而有利于植株健康生長(zhǎng)[13-15]。

在屬水平上，生防菌兌水灌根顯著提高了土壤中Gaiella的相對(duì)豐度，生防菌拌土圍根和米糠+生防菌拌土圍根顯著提高了土壤中Gemmatimonas、Pseudarthrobacter、Ramlibacter、Bradyrhizobium和Gaiella的相對(duì)豐度。研究表明，Gaiella屬于放線菌門，其相對(duì)豐度的增加可顯著抑制番茄枯萎病等土傳病害[16]。與青枯病發(fā)病土壤相比，健康土壤中Gemmatimonas、Bradyrhizobium等細(xì)菌屬的相對(duì)豐度顯著提高[10]。由此可見，生防菌兌水灌根促使土壤中Gaiella等，生防菌拌土圍根和米糠+生防菌拌土圍根促使土壤中Gaiella、Gemmatimonas、Bradyrhizobium等一些有益微生物比例上升，有利于恢復(fù)土壤健康。

需要指出的是，盡管在該研究中米糠+生防菌拌土圍根和生防菌拌土圍根在減輕煙草青枯病為害的作用中無(wú)顯著差異，但前者在調(diào)理根際土壤細(xì)菌群落多樣性以及結(jié)構(gòu)中表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。因此，從長(zhǎng)遠(yuǎn)角度講，米糠+生防菌拌土圍根可通過(guò)改善土壤微生態(tài)環(huán)境進(jìn)一步減輕煙草青枯病的為害。

4 結(jié)論

本研究探究了生防菌不同使用方式（兌水灌根、拌土圍根、米糠+生防菌拌土圍根）對(duì)煙草青枯病的防效及調(diào)節(jié)土壤細(xì)菌群落的作用，為提升生防菌的防控效果提供了理論依據(jù)。生防菌不同使用方式對(duì)青枯病的防效表現(xiàn)為米糠+生防菌拌土圍根（59.32%）＞生防菌拌土圍根（55.93%）＞生防菌兌水灌根（49.72%）。生防菌拌土圍根和米糠+生防菌拌土圍根均可顯著提高煙株根際土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度，以米糠+生防菌拌土圍根效果最為顯著。生防菌拌土圍根和米糠+生防菌拌土圍根對(duì)煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著影響，提高了土壤中放線菌門的相對(duì)豐度，促使土壤中Gaiella、Gemmatimonas、Bradyrhizobium等一些有益微生物比例上升。綜合來(lái)看，米糠+生防菌拌土圍根更有利于恢復(fù)土壤健康、減輕青枯病對(duì)煙株的為害。