方麗 林晨 王李平 張方圓 林澤鵬 李雪瑩 潘云山

摘要?[目的]建立葉菜類蔬菜中氟蟲腈及其代謝物殘留量的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。[方法]樣品經(jīng)乙腈萃取，N-丙基乙二胺鍵合硅膠固相萃取柱凈化，采用氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行確認(rèn)和定量。[結(jié)果]氟蟲腈及其代謝物在0.005～0.500 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（R2>0.999），方法檢出限為0.5 μg/kg，定量限為2 μg/kg;氟蟲腈及其代謝物的回收率為81.06%～107.1%，精密度為4.66%～18.90%。通過對(duì)100批次5種常見市售葉菜類蔬菜的篩查，陽性主要為小白菜。[結(jié)論]該方法靈敏度高，定性及定量準(zhǔn)確，適用于葉菜類蔬菜中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定。

關(guān)鍵詞?氟蟲腈;氟蟲腈代謝物;葉菜類蔬菜;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;殘留量

中圖分類號(hào)?TS?207.5+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）17-0206-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.17.053

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Determination of Fipronil and Its Metabolites Pesticide Residues in Leaf Vegetables by GC?MS

FANG Li， LIN Chen， WANG Li?ping et al

（Guangdong Provincial Engineering Research Center for Efficacy Component Testing and Risk Substance Rapid Screening of Health Food， Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals， Guangdong Institute of Analysis （China National Analytical Center Guangzhou）， Guangdong Academy of Sciences， Guangzhou， Guangdong 510070）

Abstract?[Objective] The study established determination method of fipronil and its metabolite residues in leafy vegetables by GC?MS. [Method] The sample was extracted by acetonitrile， purified with N?propyl ethylenediamine bonded silica SPE column（PSA）， confirmed and quantified by GC?MS. [Result] The fipronil and its metabolite showed good linear relationship（R2>0.999） in the concentration range of 0005-0.500 μg/mL. The method detection limit（MDL） was 0.5 μg/kg， the limit of quantification（LOQ） was 2 μg/kg; the recovery rate of fipronil and its metabolites were 81.06%-107.1%， the precision were 4.66%-18.90%. Through the detection of 100 batches leafy vegetables， the positive samples were Pakchoi. [Conclusion] The method has the advantages of high sentisivity， quantitative and qualitative accuracy， and it is suitable for the detection of fipronil and its metabolite residues in leafy vegetables.

Key words?Fipronil;Fipronil metabolites;Leafy vegetables;GC?MS;Residue

氟蟲腈（Fipronil）俗稱銳勁特（Regent），是由法國羅納-普朗克公司（Rhone-Poulenc）開發(fā)的一種高活性苯基吡唑類殺蟲劑。其殺蟲機(jī)理是阻礙昆蟲γ-氨基丁酸控制的氯化物代謝，破壞昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起其神經(jīng)和肌肉過度興奮直至死亡[1-2]。氟蟲腈對(duì)蠅類、半翅目、鱗翅目和和鞘翅目害蟲有較高的殺蟲活性，對(duì)氨基甲酸酯類、環(huán)戊二烯類及菊酯類殺蟲劑已產(chǎn)生抗性的害蟲也顯示出很高的敏感性[3-4]。氟蟲腈自1994年引入我國后，已被大范圍地用于防治水稻、蔬菜和果樹等作物的害蟲，并于2007年成為國家農(nóng)業(yè)部公布的第1批替代禁用高毒農(nóng)藥的首推產(chǎn)品，但是其對(duì)環(huán)境不友好，在土壤和水中的降解緩慢，且對(duì)甲殼類水生物、蝴蝶、蜜蜂、蜻蜓等具有高風(fēng)險(xiǎn)。2009年10月1日，氟蟲腈就被列為（禁）限用農(nóng)藥，僅能用于衛(wèi)生殺蟲、玉米等部分旱田種子包衣劑和專供出口產(chǎn)品[5]。氟蟲腈施用后進(jìn)入環(huán)境，通常會(huì)分解產(chǎn)生4種代謝物——光解產(chǎn)物氟甲腈（MB46513）、氧化產(chǎn)物氟蟲腈砜（MB46136）、還原產(chǎn)物氟蟲腈硫醚（MB45950）、水解產(chǎn)物氟蟲腈酰胺（RPA200766），轉(zhuǎn)化條件及物質(zhì)結(jié)構(gòu)式見圖1。當(dāng)pH>9時(shí)，氟蟲腈水解緩慢，產(chǎn)生氟蟲腈酰胺，其代謝物一般為氟甲腈、氟蟲腈砜及氟蟲腈硫醚。故筆者基于氟蟲腈及其3種代謝物氟甲腈、氟蟲腈砜及氟蟲腈硫醚，開展了該研究。

目前，檢測氟蟲腈殘留量的常見方法包括氣相色譜-電子捕獲檢測法（GC-ECD）[6-7]液相色譜法（LC）[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10-12]、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[13-15]?！禛B 2763—2019食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中，氟蟲腈殘留物是以氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜之和計(jì)[16]。現(xiàn)行國標(biāo)《GB 23200.8—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》僅包含了氟蟲腈，且定量限為0.1 mg/kg，高于GB 2763中氟蟲腈限量0.02 mg/kg的要求。盡管《SN/T 1982—2007進(jìn)出口食品中氟蟲腈殘留量檢測方法 氣相色譜-質(zhì)譜法》氟蟲腈測定低限為0.002 mg/kg能夠滿足限量要求，但該方法也只包含了氟蟲腈，且采用負(fù)化學(xué)電離（CI），該電離源的使用遠(yuǎn)不及EI普遍。

筆者采用氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)葉菜類蔬菜中的氟蟲腈及其3種代謝物殘留量進(jìn)行測定，優(yōu)化了萃取條件、凈化方式以及儀器參數(shù)，建立了氣質(zhì)聯(lián)用法測定葉菜類蔬菜中的氟蟲腈及其代謝物殘留量，并對(duì)葉菜類蔬菜進(jìn)行了初步篩查和相關(guān)統(tǒng)計(jì)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1

試劑。乙腈（色譜純，Honeywell）;丙酮（色譜純，Honeywell）;正己烷（色譜純，Honeywell）;乙酸乙酯（色譜純，Honeywell）;氯化鈉（分析純，廣試）;無水硫酸鈉（分析純，廣試，在650 ℃下灼燒4 h，貯存于干燥器中，冷卻備用）;固相萃取柱，規(guī)格為1 000 mg/6 mL，填料分別為氨丙基鍵合硅膠（NH2）、二醇基鍵合硅膠（Diol）、N-丙基乙二胺鍵合硅膠（PSA，SHIMADZU/島津）;QuEChERS（上海安譜）。

1.1.2

標(biāo)準(zhǔn)品。氟蟲腈（Fipronil，CAS No.：120068-37-3，100 μg/mL于甲醇溶液，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所）;氟甲腈（Fipronil-desulfinyl，CAS No.：205650-65-3，100 μg/mL于丙酮溶液，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所）;氟蟲腈硫醚（即氟蟲腈亞砜，F(xiàn)ipronil-sulfide，CAS No.：120067-83-6，99.5%，Dr.Ehrenstorfer）;氟蟲腈砜（Fipronil-sulfone，CAS No.：120068-36-2，98.5%，Dr.Ehrenstorfer）。

1.1.3

樣品。葉菜類蔬菜，包括大白菜、小白菜、菠菜、芹菜、油麥菜。

1.2?儀器設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電子轟擊源）（Agilent 7890A-5975C，美國安捷倫科技公司）、食品料理機(jī)（E320，美國Vitamix）、氮吹儀（N-EVAP 112，美國Organomation）、移液器（Gilson，美國吉爾森）、電子天平（Sartorius， 德國賽多利斯）、均質(zhì)機(jī)（IKA T18，德國艾卡）、高速冷凍離心機(jī)（CF 16RXⅡ，日本Hitachi）、離心管（50 mL，美國Labcon）、BOMEX濃縮瓶（50 mL，刻度1 mL，北京博美玻璃有限公司）、塑料滴管（3 mL，環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.3?樣品的制備

1.3.1

預(yù)處理。蔬菜去除根，取整棵，于無色、清潔的聚乙烯塑料薄膜上，切碎，充分混勻后，放入食品料理機(jī)中搗碎成勻漿，收集在密封袋中做好標(biāo)識(shí)，備用。

1.3.2

提取。稱取10 g（精確至0.001 g）制備樣于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，用均質(zhì)機(jī)在10 000 r/min下勻漿提取1 min，加入3 g氯化鈉，再勻漿1 min;4 ℃下10 000 r/min冷凍離心5 min后，取10 mL上層清液，加入3 g無水硫酸鈉，渦旋30 s后靜置10 min，過濾，并用5 mL的乙腈分兩次洗滌殘?jiān)?0 ℃水浴下氮吹至近干。

1.3.3

凈化。用5 mL丙酮+正己烷（3∶7，體積比）活化PSA固相萃取柱，在樣液瓶中加入1 mL丙酮+正己烷（3∶7，體積比），渦旋1 min后，轉(zhuǎn)移至活化后的PSA固相萃取柱;再分3次，每次用3 mL丙酮+正己烷（3∶7，體積比）洗滌樣液瓶，并將洗滌液移入柱中，收集所有流出液于濃縮瓶中，50 ℃水浴下氮吹濃縮至1 mL。

1.4?標(biāo)準(zhǔn)品的制備

分別準(zhǔn)確稱取氟蟲腈硫醚、氟蟲腈砜0.05 g至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至50 mL，配置成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;分別移取氟蟲腈硫醚、氟蟲腈砜的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL）各0.10 mL，氟蟲腈、氟甲腈（100 μg/mL）各1.0 mL至50 mL的容量瓶中，用甲醇定容至50 mL，配制成2 μg/mL的混標(biāo)溶液;再依次分別取0.025、0050、0.250、0.500、1.000、2.500 mL的混標(biāo)溶液至10 mL容量瓶中，定容至10mL，配制成0.005、0.010、0.050、0.100、0200、0.500 μg/mL作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線。

1.5?分析條件

1.5.1

色譜條件。色譜柱：DB-5MS UI（30 m×0.25 mm×025 μm）;進(jìn)樣體積：1 μL;進(jìn)樣口溫度：250 ℃;進(jìn)樣模式：脈沖不分流;載氣：高純He，純度99.999%;流速：1.2 mL/min;升溫程序：80 ℃（保持1min），20 ℃/min升溫至160 ℃，5 ℃/min升溫至230 ℃，30 ℃/min升溫至280 ℃后運(yùn)行2 min。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2020年

1.5.2

質(zhì)譜條件。離子源：電子轟擊式離子源（EI，70eV）;傳輸線溫度：280 ℃;離子源溫度：230 ℃;四極桿溫度：150 ℃;溶劑延遲：10 min;采集模式：選擇離子監(jiān)測（SIM），氟甲腈（388，333，369，213），氟蟲腈硫醚（351，420，255，213），氟蟲腈（367，369，213，255），氟蟲腈砜（383，255，213，452），其中帶下劃線質(zhì)核比（m/z）為定量離子，其余3個(gè)為定性離子。

2?結(jié)果與分析

2.1?色譜柱選擇及條件優(yōu)化

DB-5MS UI作為超高惰性非極性固定相色譜柱，由于固定相甲基硅氧烷骨架上接枝有5%的苯基，使其極性比以100%甲基聚硅氧烷作為固定相的SE-30稍高，該色譜柱具有良好的柱惰性、極低的柱流失和分離效率較高等優(yōu)點(diǎn)。

由于氟蟲腈及其代謝物性質(zhì)較為接近，在色譜柱上的流出時(shí)間間隔較近，尤其是氟蟲腈硫醚和氟蟲腈，為了獲得完全分離的色譜峰，使分離度R>1.5，故在程序升溫中部采取5 ℃/min慢速升溫，待最后出峰的氟蟲腈砜流出后，快速升溫，趕出與固定相吸附較強(qiáng)的物質(zhì)，防止柱污染，延長毛細(xì)管柱使用壽命。氟蟲腈及其代謝物的總離子流圖如圖2所示。

2.2?萃取條件的選擇與優(yōu)化

由于氟蟲腈在太陽光照下會(huì)緩慢降解，且在水溶液中經(jīng)光照會(huì)快速分解，因此在整個(gè)試驗(yàn)過程中，采用避光操作。氟蟲腈及其代謝物在溶劑中的溶解性會(huì)隨溶劑的極性降低而逐漸降低，該試驗(yàn)的測試對(duì)象為葉菜類蔬菜，含水量大，用極性大的溶劑進(jìn)行萃取，需要進(jìn)行鹽析，而極性大的甲醇、乙醇在加入氯化鈉后，不易于水相分層。因此，筆者采取在空白樣品加入氟蟲腈及其代謝物混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式，分別考察了乙腈、丙酮和乙酸乙酯3種萃取試劑的萃取效果，回收率如圖3所示。

由圖3可知，不同溶劑的萃取效率大小依次為乙腈>丙酮>乙酸乙酯，氟蟲腈及其代謝物在乙酸乙酯中的溶解度相對(duì)較低，故其回收率小;采用乙腈和丙酮作為溶劑時(shí)，回收率差別不明顯，但是采用丙酮作為溶劑時(shí)，樣品的基線較高，影響目標(biāo)物峰形，進(jìn)而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，采用乙腈作為萃取溶劑對(duì)葉菜類蔬菜中的氟蟲腈及其代謝物進(jìn)行萃取。

2.3?凈化條件的選擇與優(yōu)化

由于氟蟲腈及其代謝物屬于極性物質(zhì)，考慮采用含有極性填料的固相萃取柱，以達(dá)到凈化的目的。筆者分別考察了同種規(guī)格（1 000 mg，6 mL）、不同填料

的固相萃取柱（Solid Phase extraction Cartridges，SPE），包括

氨丙基鍵合硅膠（NH2）、二醇基鍵合硅膠（Diol）、N-丙基乙二胺鍵合硅膠（PSA），同時(shí)考察了農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速方法——QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）。采用向制備好的蔬菜樣品中添加氟蟲腈及其代謝物混標(biāo)的方式，觀察并比較4種不同的固相萃取柱凈化效果及萃取效率，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，回收率大小依次為PSA> QuEChERS > NH2> Diol。通過觀察樣品色譜峰的雜峰數(shù)目、大小及基線響應(yīng)值，在凈化效果上，PSA> NH2> Diol > QuEChERS。QuEChERS具有高回收率、分析范圍廣、使用溶劑少、操作簡便、前處理速度快等優(yōu)點(diǎn)，但是由于QuEChERS去除樣品中雜質(zhì)的能力弱，而GC-MS法往往需要對(duì)凈化溶液進(jìn)行濃縮，以實(shí)現(xiàn)較低的檢出限，而使用GC-MS分析QuEChERS處理的樣品，存在雜峰較多、基線較高等問題。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇PSA固相萃取柱進(jìn)行凈化。

2.4?方法的檢出限、準(zhǔn)確度及精密度評(píng)估

氟蟲腈及其代謝物在0.005～0.500 μg/mL的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（R2>0.999），以3倍信噪比（S/N）計(jì)算方法檢出限，10倍信噪比（S/N）計(jì)算方法定量限，線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表1。

分別在制備好的蔬菜樣品中加入一定量的氟蟲腈及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平分別為2、10、50 μg/kg，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行萃取、凈化、濃縮及GC-MS分析，重復(fù)試驗(yàn)6次，獲得平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表2所示。由表2可見，氟蟲腈及其代謝物回收率為81.06%～107.1%，精密度為4.66%～18.9%，能夠滿足定量要求。

2.5?葉菜類蔬菜氟蟲腈及其代謝物含量

考察了100批次的大白菜、小白菜、菠菜、芹菜、油麥菜共5種常見的市售葉菜類蔬菜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除小白菜外，其余葉菜類蔬菜均未檢出氟蟲腈及其代謝物。在檢出氟蟲腈的6個(gè)小白菜樣品中，除氟蟲腈外，其3種代謝物氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈砜均有檢出，結(jié)果如圖5所示。

3?結(jié)論

該研究采用乙腈萃取、PSA固相萃取柱凈化、氣相色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，建立了同步測定葉菜類蔬菜中氟蟲腈及其3種代謝物的方法。與國標(biāo)方法相比較，該方法涵蓋了GB 2763—2016及歐盟限量規(guī)定中氟蟲腈的全部殘留物，

彌補(bǔ)了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的不足;檢出限更低，能夠滿足限量指標(biāo)的

要求;通過色譜條件的優(yōu)化和萃取、凈化條件的篩選，降低了基質(zhì)干擾;經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，該方法線性、檢出限、回收率及精密度等均滿足殘留檢測方法確認(rèn)要求，適用于葉菜類蔬菜中氟蟲腈及其代謝物的測定;通過對(duì)100批次的大白菜、小白菜、菠菜、芹菜、油麥菜5種常見的市售葉菜類蔬菜的篩查，發(fā)現(xiàn)其中有6個(gè)小白菜為陽性。綜上所述，該方法靈敏度高，定性及定量準(zhǔn)確，適用于葉菜類蔬菜中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定。

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