張金蓮 劉金華 包涵 李冬萍 宋娟 黃京華 陳廷速

摘? 要：以發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）K599誘導(dǎo)胡蘿卜產(chǎn)生毛狀根，接種叢枝菌根（AM）真菌摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae）建立雙重培養(yǎng)體系，研究不同消毒方法、超聲波、低溫預(yù)處理和培養(yǎng)基pH對摩西斗管囊霉孢子萌發(fā)的影響及其與胡蘿卜毛狀根建立雙重培養(yǎng)體系的最佳條件。研究結(jié)果表明：消毒方法3孢子萌發(fā)率最高，孢子污染率最低，15 d孢子萌發(fā)率達(dá)48.88%，而污染率僅為9.98%;超聲波處理能降低孢子污染率11.17%～14.53%;低溫預(yù)處理可有效提高孢子的萌發(fā)率，4 ℃低溫處理10 d和15 d效果較好，其萌發(fā)率分別為70%和65%;AM真菌孢子在水瓊脂培養(yǎng)基萌發(fā)最佳pH為6.5，萌發(fā)率達(dá)到48.50%，pH<5.5或pH>8.0均抑制孢子萌發(fā)，pH 5.5和pH 8.0的萌發(fā)率分別為15.43%和16.06%。消毒孢子先于水瓊脂萌發(fā)后，再挑取萌發(fā)管多，菌絲較長的孢子并將菌絲生長方向正對毛狀根方向進(jìn)行轉(zhuǎn)接，可以提高雙重培養(yǎng)的成功率。MSR培養(yǎng)基為雙重培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基。胡蘿卜毛狀根與AM真菌雙重培養(yǎng)可為菌根真菌繁殖及相關(guān)分子機(jī)理研究提供可行有效的途徑。

關(guān)鍵詞：胡蘿卜毛狀根;發(fā)根農(nóng)桿菌;叢枝菌根真菌;摩西斗管囊霉;雙重培養(yǎng)

中圖分類號：S154.3? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： Agrobacterium rhizogenes K599 was used to induce carrot hair roots. An in vitro dual culturing system with Funneliformis mosseae and carrot hairy roots was then developed， and factors including methods to obtain axenic， supersonic processing， chilling treatment and medium pH that might affect both AM fungal spores germination and dual culturing were optimized. It was found that the third axenic method resulted in the highest germination rate （48.88%） and the lowest contamination rate （9.98%） at 15 days. Supersonic processing helped reduce AM fungal spores contamination by 11.17% to 14.53%， while a chilling pretreatment at 4 ℃ for 10 days and 15 days increased the germination rate of AM fungal spores to 70% and 65%， respectively. In water agar， the highest germination rate was achieved at a pH of 6.5 （48.50%）， whereas spore germination was inhibited when pH was lower than 5.5 or higher than 8.0， with germination rate decreased to 15.43% at pH 5.5 and 16.06% at pH 8.0. Furthermore， it was found that the success rate of dual culturing was enhanced when sterilized spores were first germinated on agar medium and long hyphae were then selected for inoculation with their extension direction towards the growth direction of the carrot root. The MSR medium was found to be optimal for dual culture. The successful in vitro dual culture of carrot hairy roots and arbuscula mycorrhizal fungi provides an ideal experimental system to obtain pure AM fungal spores and to conduct future studies on the physiological and molecular mechanism of carrot mycorrhiza.

Keywords： carrot hair roots; Agrobacterium rhizogenes; arbuscular mycorrhizal fungi; Funneliformis mosseae; dual culture

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.005

叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal， AM）是自然界中分布最廣和最普遍的一種菌根類型，80%以上的陸生植物都具有叢枝菌根[1-2]。AM真菌具有促進(jìn)植物對土壤中礦質(zhì)營養(yǎng)吸收，提高植物的產(chǎn)量與質(zhì)量、在重金屬污染修復(fù)上的重要作用，在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)上具有廣闊的應(yīng)用前景[3-7]。AM真菌常用活體盆栽繁殖，但大規(guī)模繁殖存在成本高，培養(yǎng)周期長等缺點(diǎn)[8]，在農(nóng)林業(yè)上的作用受到限制[9]。因此，開展AM真菌的生物學(xué)研究，實(shí)現(xiàn)AM真菌高效繁殖是AM真菌研究的重要方向[10]。

由于AM真菌不能純培養(yǎng)，限制了對AM真菌與宿主植物共生機(jī)理、AM真菌純培養(yǎng)及改善宿主植物營養(yǎng)和抗逆性的相關(guān)機(jī)理研究。利用植物根系或發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物誘導(dǎo)獲得的毛狀根作為寄主能進(jìn)行AM真菌的離體培養(yǎng)。由植物根系建立的共生體系生長緩慢，而離體毛狀根能夠在無激素培養(yǎng)基上快速生長，同時存活時間較植物根系長，也能保持良好的遺傳特性，是AM真菌雙重培養(yǎng)理想的宿主材料[11]，有利于開展AM真菌生物學(xué)特性研究[12]。

雙重培養(yǎng)體系在胡蘿卜[13-14]、人參[15]、番茄[16]、大豆[17]、紫云英[18]和白三葉[19]植物中已經(jīng)獲得成功。但不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對同一種植物的發(fā)根能力有差異，不同AM真菌菌株與不同植物毛狀根的親和力也不相同。利用發(fā)根農(nóng)桿菌A4、LBA9402和R100菌株誘導(dǎo)胡蘿卜毛狀根，最終LBA9402未能誘導(dǎo)出毛狀根，A4誘導(dǎo)能力強(qiáng)于R100[14]。離體條件下的孢子萌發(fā)是影響雙重培養(yǎng)的主要因素，通過解除AM真菌孢子休眠期來提高孢子萌發(fā)率[20]。目前只有一些AM真菌的種能與毛狀根建立離體的共培養(yǎng)，也許孢子的表面消毒處理影響了萌發(fā)，Rhizoglomus irregulare （syn. Rhizophagus irregularis）是最成功的離體雙重培養(yǎng)體系[21]。ATCC 11325菌株能誘導(dǎo)胡蘿卜產(chǎn)生毛狀根，并與Glomus mosseae建立離體雙重培養(yǎng)體系[22];K599菌株成功誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生毛狀根并與珠狀巨孢囊霉（Gigaspora margarita）也建立了雙重培養(yǎng)體系共生關(guān)系[17]。

甘蔗根際土壤有豐富的AM真菌資源[23-25]，大田接種AM真菌能提高甘蔗的產(chǎn)量[26-28]。本研究用發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599誘導(dǎo)胡蘿卜肉質(zhì)根產(chǎn)生毛狀根，此毛狀根生長速度快，能產(chǎn)生許多分枝，材料易獲得。利用分離自廣西甘蔗根際土壤的優(yōu)勢菌株摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae）孢子侵染胡蘿卜離體毛狀根，建立雙重培養(yǎng)體系，同時對AM真菌孢子萌發(fā)條件以及雙重培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化，探索利用離體雙重培養(yǎng)體系大量生產(chǎn)AM真菌孢子，進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)AM菌劑，推進(jìn)菌根甘蔗種苗得到推廣應(yīng)用，也為不同AM真菌菌株與植物毛狀根共生關(guān)系的建立提供參考。這也將有助于研究AM真菌與胡蘿卜根系的共生機(jī)制、基因的功能及相關(guān)的分子機(jī)制;為AM真菌與不同植物之間的共生關(guān)系及物質(zhì)和信息之間的傳遞及AM真菌的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菌株和菌劑? 發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株為K599，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)王秀榮老師惠贈。AM真菌菌株為從甘蔗根際土壤單孢分離純化獲得的摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae），由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所土壤微生物研究室保藏。

1.1.2? 植物材料? 供試胡蘿卜為新鮮胡蘿卜（采摘不超過5 d），商品名稱為‘韓紅六寸參，市售。

1.1.3? 所用抗生素、生長素及孢子消毒劑? 羧芐青霉素（carbenicillin，Car），乙酰丁香酮（acetosyringone，AS），維生素C（ascorbic acid），頭孢噻肟（cefotaxime sodium），氯胺T（源葉生物），鏈霉素（源葉生物），硫酸慶大霉素（源葉生物）和吐溫20。

1.1.4? 培養(yǎng)基? （1）農(nóng)桿菌活化YEP培養(yǎng)基：牛肉浸膏5 g/L+酵母膏1 g/L+蛋白胨5 g/L+蔗糖5 g/L+NaCl 5 g/L+MgSO4·7H2O 4 g/L，pH 7.0;（2）農(nóng)桿菌預(yù)處理培養(yǎng)基：MS液體培養(yǎng)基，pH 5.5;（3）外植體與發(fā)根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的培養(yǎng)基：1%水瓊脂+維生素C（500 mg/L）+乙酰丁香酮（100 mg/L），pH 5.5;（4）除菌培養(yǎng)基Ⅰ：1%水瓊脂+維生素C（500 mg/L）+乙酰丁香酮（100 mg/L）+羧芐青霉素（500 mg/L），pH 5.5;（5）除菌培養(yǎng)基Ⅱ：MM培養(yǎng)基（0.3%瓊脂）+頭孢噻肟（500 mg/L），pH 5.5;（6）孢子萌發(fā)培養(yǎng)基：0.8%水瓊脂培養(yǎng)基;（7）毛狀根繼代及雙重培養(yǎng)的培養(yǎng)基：MM、MSR培養(yǎng)基，pH 5.5。

1.2? 方法

1.2.1? 胡蘿卜毛狀根誘導(dǎo)

（1）發(fā)根農(nóng)桿菌感染菌液的制備。農(nóng)桿菌活化后，挑取單菌落于YEP液體培養(yǎng)基中28 ℃黑暗培養(yǎng)1 d，200 r/min。用移液槍吸取1 mL搖好的菌液加入MS液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)5 h。當(dāng)OD600值約為0.6～0.8時，制備成感染菌液。

（2）毛狀根的誘導(dǎo)。新鮮的胡蘿卜用清水清洗干凈后，削去其外表皮，75%酒精浸泡10 s，1%次氯酸鈉溶液20 min，無菌水沖洗4～5次后，將胡蘿卜橫切成約1 cm厚的圓片，分別擺放于12 cm培養(yǎng)皿中的共培養(yǎng)基上，每皿放1片。將活化的菌液滴1～2滴在胡蘿卜切片的中心處。25 ℃暗培養(yǎng)3 d后，用無菌水沖洗2～3次，轉(zhuǎn)接到除菌培養(yǎng)基Ⅰ中繼續(xù)暗培養(yǎng)。期間注意觀察、拍照記錄胡蘿卜切片的變化。每3 d重復(fù)轉(zhuǎn)接1次。

（3）毛狀根的繼代培養(yǎng)。當(dāng)胡蘿卜片形成層產(chǎn)生的毛狀根長度為3 cm左右時，無菌操作將毛狀根剪下轉(zhuǎn)接到除菌培養(yǎng)基Ⅱ中暗培養(yǎng)（25 ℃），每3 d轉(zhuǎn)接1次，直至細(xì)菌除盡，將其轉(zhuǎn)接到不含任何抗生素和激素的MM培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。每月轉(zhuǎn)接1次，實(shí)現(xiàn)毛狀根的擴(kuò)繁。

1.2.2? 摩西斗管囊霉-胡蘿卜毛狀根雙重培養(yǎng)體系建立

（1）無菌AM真菌孢子制備。①AM真菌孢子的超聲波處理：采用濕篩傾析法篩選大小、顏色均勻飽滿的AM真菌孢子。用超聲波震蕩法去除孢子表面雜質(zhì)，具體方法為將挑選的AM真菌孢子放入1.5 mL離心管中，加入0.1 mL無菌水，用封口膜封緊蓋口后，放入KQ3200DE型超聲波清洗器中超聲波處理（功率為40 W，時間2 min）。然后在顯微鏡下挑取質(zhì)地均勻，顏色相近，無破損，有活力的孢子。②AM真菌孢子的低溫處理：將已進(jìn)行超聲波處理的AM真菌孢子放入4 ℃冰箱中低溫處理。時間梯度設(shè)計為5、10、15和20 d，同時將只進(jìn)行超聲波處理不做低溫處理的AM真菌孢子設(shè)置為對照組。③AM真菌孢子的表面消毒：a. 方法1：消毒液為2%（w/v）氯胺T+200 mg/L鏈霉素+100 mg/L硫酸慶大霉素+2滴吐溫20，混勻后過0.22 m濾膜。將AM真菌孢子浸泡在消毒液10 min，無菌水沖洗孢子3～5次后挑入1.5 mL離心管中，于28 ℃下培養(yǎng)3 d后重復(fù)消毒1次，待用。b. 方法2：消毒液為5%（w/v）氯胺T+0.04%鏈霉素+2滴吐溫20，混勻后過0.22 m濾膜。將AM真菌孢子浸泡在消毒液10 min，無菌水沖洗3～5次，待用。c. 方法3：消毒液A為2%（w/v）氯胺T和2滴吐溫20，混勻后過0.22 m濾膜;消毒液B為200 mg/L鏈霉素+100 mg/L硫酸慶大霉素混合液。將AM真菌孢子浸泡在消毒液A中10 min，無菌水沖洗3～5次后轉(zhuǎn)入消毒液B中浸泡10 min，無菌水沖洗3～5次，待用。

（2）pH對AM真菌孢子萌發(fā)的影響。將消毒的AM真菌孢子接種于pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的孢子萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，統(tǒng)計孢子的萌發(fā)率和污染率，比較培養(yǎng)基不同pH值對孢子萌發(fā)的影響。

（3）AM真菌孢子的接種和培養(yǎng)。①方法1：挑取已萌發(fā)的孢子轉(zhuǎn)接預(yù)先接種了毛狀根的MM和MSR培養(yǎng)基中。具體方法：用已滅菌的直徑0.5 cm的打孔器把胡蘿卜毛狀根根尖附近的培養(yǎng)基切下一塊并將其移除。同時將相同大小的帶有已萌發(fā)孢子的培養(yǎng)基塊填入到挖空的培養(yǎng)基中，盡量將孢子靠近毛狀根，縮短菌絲和毛狀根相接觸的時間。②方法2：用移液槍將消毒的AM真菌孢子（約20個/皿）接入毛狀根附近（直徑約2 cm范圍內(nèi)）。

用上述2種方法接種完成后，用醫(yī)用封口膜密封培養(yǎng)皿，置于25 ℃暗培養(yǎng)。期間，每隔3 d用顯微鏡觀察孢子是否萌發(fā)，菌絲能否與毛狀根接觸建立雙重培養(yǎng)。

（4）毛狀根菌根侵染檢測。毛狀根的菌根染色主要參考文獻(xiàn)[29]和[30]的方法，在處理時間上略有改動。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS Statistics 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。運(yùn)用ANOVA單因素方差分析和Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 胡蘿卜毛狀根的誘導(dǎo)

發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599侵染胡蘿卜肉質(zhì)根后，

約15 d長出3～4 cm的毛狀根（圖1A）。轉(zhuǎn)接入除菌培養(yǎng)基Ⅱ后，20 d毛狀根開始分枝迅速生長（圖1B）。3次除菌后轉(zhuǎn)入無激素和抗生素的MM培養(yǎng)基，毛狀根生長迅速，30 d可長滿直徑為12 cm的培養(yǎng)皿（圖1C）。新長出的毛狀根具有多分支、向上或沿培養(yǎng)基生長及無向地性，在不含任何激素的MM培養(yǎng)基中生長迅速等典型特征，可作為宿主用于AM真菌侵染。

2.2? AM真菌孢子萌發(fā)條件的優(yōu)化

2.2.1? 不同消毒方法對AM真菌孢子萌發(fā)率和污染率的影響? 為獲得有活力且沒有雜菌污染的孢子，從孢子萌發(fā)率和污染率來比較3種不同消毒方法的消毒效果。消毒方法1消毒時間長，消毒方法繁瑣，從孢子萌發(fā)率和污染率來看，消毒效果居中;方法2孢子污染率最高，15 d污染率達(dá)31.02%，孢子萌發(fā)率為35.94%，萌發(fā)率在3種方法中最低，效果最差;方法3既可以獲得更多無污染的孢子，且萌發(fā)率最高，15 d孢子萌發(fā)率達(dá)48.88%，而污染率僅為9.98%（表1）。

2.2.2? 超聲波對AM真菌孢子萌發(fā)的影響? 孢子消毒前是否進(jìn)行超聲波處理，對AM真菌孢子的萌發(fā)率沒有顯著影響，但可以顯著降低孢子的污染率。消毒方法1超聲波處理比不處理污染率降低11.17%;方法2超聲波處理能降低污染率14.53%;方法3超聲波處理能降低污染率13.43%（表2）。說明超聲波處理在不影響孢子萌發(fā)率的同時可進(jìn)一步減少孢子雜質(zhì)，利于孢子的徹底消毒。

2.2.3? 低溫處理對AM真菌孢子萌發(fā)的影響? 經(jīng)過低溫處理的孢子萌發(fā)率均顯著高于未經(jīng)低溫處理的孢子。其中，4 ℃低溫處理10 d孢子萌發(fā)率最高70%，低溫處理15 d孢子萌發(fā)率最高65%;其次為低溫處理5 d和20 d，二者差異不顯著。萌發(fā)率最低的為未經(jīng)低溫處理的孢子（圖2）。

2.2.4? 培養(yǎng)基的pH對AM真菌孢子萌發(fā)的影響? 將已消毒的孢子分別接種于pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的水瓊脂培養(yǎng)基。培養(yǎng)第18天，孢子在pH 6.5的水瓊脂上萌發(fā)率為48.49%，顯著高于其他pH的培養(yǎng)基。pH<5.5或pH>8.0時，均會一定程度抑制孢子的萌發(fā)，pH 5.5和8.0的萌發(fā)率分別為15.43%和16.06%（表3）。

2.3? 胡蘿卜毛狀根與摩西斗管囊霉雙重培養(yǎng)

萌發(fā)的摩西斗管囊霉（F. mosseae）孢子接入MSR培養(yǎng)基中的毛狀根附近后，3～7 d菌絲即與毛狀根接觸，此后，菌絲生長速度加快，菌絲分枝的數(shù)量增多（圖3A、圖3B）。30～40 d陸續(xù)有新的AM真菌菌絲伸出，菌絲相互交錯形成菌絲網(wǎng)，繼續(xù)侵染其它毛狀根（圖3C、圖3D）。未接觸到根段的菌絲可分化成3～4級的分枝吸收結(jié)構(gòu)（branched absorbing structures， BAS）（圖3C）。50～70 d后，幼嫩的新生孢子開始形成（圖3D），培養(yǎng)100～120 d，新生的孢子成熟，形態(tài)上與母孢子無明顯的差別（圖3E、圖3F）。

采用Boss藍(lán)黑墨水將侵染后60 d的胡蘿卜毛狀根染色后，在顯微鏡下可觀察到菌絲進(jìn)入皮層，并在細(xì)胞間隙中延伸，在皮層內(nèi)形成了大量的根內(nèi)菌絲，但顯微鏡下未觀察到泡囊和叢枝結(jié)構(gòu)（圖3G、圖3H）。這可能是由于取樣時間的選取問題，叢枝結(jié)構(gòu)已降解而泡囊還未形成。

培養(yǎng)基成分對F. mosseae與胡蘿卜毛狀根雙重培養(yǎng)體系的建立和孢子的形成具有重要影響。萌發(fā)的孢子分別接入MM和MSR培養(yǎng)基后發(fā)現(xiàn)，MSR培養(yǎng)基更有利于促進(jìn)孢子的菌絲和根相接觸，3～5 d即可與毛狀根接觸（圖3A、圖3B）;50～70 d后開始有新生孢子產(chǎn)生（圖3D）。接入MM培養(yǎng)基的孢子生長速度相對較慢，5～7 d可與毛狀根接觸，大部分孢子的菌絲未接觸毛狀根就停止生長。MM培養(yǎng)基中AM真菌不能與胡蘿卜毛狀根建立雙重培養(yǎng)。

3? 討論

利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌株成功誘導(dǎo)胡蘿卜產(chǎn)生毛狀根，在無激素和抗生素的MM和MSR培養(yǎng)基中生長良好，30 d可長滿直徑為12 cm的培養(yǎng)皿。新長出的毛狀根具有多分支、向上或沿培養(yǎng)基生長、無向地性和在不含任何激素的MM培養(yǎng)基中生長迅速等典型特征。

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