姜 燕 徐永江 于超勇 柳學(xué)周 王 濱 鄭煒強(qiáng) 官曙光 史 寶 陳 佳 柯巧珍

大黃魚消化道菌群結(jié)構(gòu)、消化酶和非特異性免疫酶活力分析*

姜 燕1,2徐永江2于超勇3柳學(xué)周1,2①王 濱2鄭煒強(qiáng)1官曙光3史 寶2陳 佳1柯巧珍1

(1. 大黃魚育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司 寧德 352103；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 山東省海洋生物研究院 青島 266104)

為研究大黃魚()消化道的菌群結(jié)構(gòu)、消化酶和非特異性免疫酶活力特征，本研究采用高通量測序技術(shù)系統(tǒng)分析大黃魚胃、幽門盲囊和腸道中菌群組成及分布，并對比研究工廠化養(yǎng)殖和網(wǎng)箱養(yǎng)殖模式下的消化道菌群；同時(shí)，結(jié)合生化分析方法解析2種模式下消化道消化酶和非特異性免疫酶活力特征。結(jié)果顯示，2種養(yǎng)殖模式下，菌群多樣性隨消化道延伸呈下降趨勢；乳桿菌科(Lactobacillaceae(f))、、黃桿菌屬()等代表的菌屬為共有優(yōu)勢菌群。其中，擬桿菌屬()和等的豐度隨消化道延伸呈下降趨勢，而乳桿菌科、E01_9C_26_marine_group(o)所代表的菌屬及黃桿菌屬等則相反；普氏菌屬(_9)、乳桿菌科代表的菌屬為2種模式養(yǎng)殖大黃魚的主要差異菌屬。工廠化養(yǎng)殖條件下，幽門盲囊和腸道中的菌群組成及其參與營養(yǎng)和免疫相關(guān)代謝通路的基因數(shù)目差異不顯著(>0.05)，但與胃部的菌群組成和相關(guān)代謝通路基因數(shù)目存在明顯差異；而網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚胃部與幽門盲囊和腸道的菌群結(jié)構(gòu)及相關(guān)代謝通路基因數(shù)目差異相對較小。2種養(yǎng)殖模式下的大黃魚消化道菌群與飼料菌群相近。另外，胃和幽門盲囊也具有非特異性免疫酶活性，說明，整個(gè)消化道還具有一定的化學(xué)免疫屏障作用。本研究結(jié)果將為大黃魚健康養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)參考，并為消化道菌群生理功能探討提供理論依據(jù)。

大黃魚；消化道；菌群；消化酶；非特異性免疫酶；養(yǎng)殖模式

大黃魚()是我國的重要經(jīng)濟(jì)魚種之一，其產(chǎn)業(yè)鏈為我國帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年，我國大黃魚產(chǎn)量為177640 t，是2016年的1.11倍，僅福建省產(chǎn)量高達(dá)150542 t，占全國大黃魚總產(chǎn)量的84.75%(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等, 2018)?？梢?，福建省是我國大黃魚重要的養(yǎng)殖產(chǎn)地。但是，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷壯大，養(yǎng)殖密度脅迫、養(yǎng)殖用水和飼料質(zhì)量等各種問題不斷涌現(xiàn)，導(dǎo)致大黃魚養(yǎng)殖病害頻發(fā)，包括弧菌病、細(xì)菌性腸炎病、刺激隱核蟲病等在內(nèi)的細(xì)菌性疾病、寄生蟲病等病害種類呈現(xiàn)上升趨勢，成為限制產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的一大“瓶頸”(杜明洋等, 2017)。由于細(xì)菌具有種類多、繁殖快、傳播途徑多樣化等特點(diǎn)，因此，養(yǎng)殖過程中仍以細(xì)菌性疾病為主。

隨著人們對健康、環(huán)保意識的不斷增強(qiáng)，在對細(xì)菌性疾病的治療方面，疫苗、益生菌等生物防治措施備受關(guān)注(Nayak, 2010; Cai, 2013; Li, 2016)。這些生物產(chǎn)品仍以微生物為主，而消化道內(nèi)居住著數(shù)以萬億計(jì)的微生物，其攜帶的基因數(shù)量遠(yuǎn)超宿主基因組的上百倍，并且可通過結(jié)構(gòu)變化調(diào)整自身功能基因在某一代謝通路中的富集，從而在營養(yǎng)、免疫等多方面參與并影響宿主的生理活動(Shabat, 2016; Zhang, 2016; Dwivedi, 2017)。同時(shí)，消化道菌群的動態(tài)平衡是維持消化道健康的一個(gè)重要保障，也是菌群協(xié)同宿主進(jìn)行各種生理功能的必要前提。因此，對消化道菌群組成信息、分布特征進(jìn)行系統(tǒng)分析是后續(xù)開展“土著”益生菌篩選、結(jié)構(gòu)有效調(diào)控及其機(jī)理等相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)。

本研究以工廠化和網(wǎng)箱模式養(yǎng)殖大黃魚為研究對象，針對其胃、幽門盲囊和腸道中的菌群分布特征、組成信息及其參與營養(yǎng)和免疫相關(guān)代謝功能的基因信息進(jìn)行對比分析，明確消化道菌群結(jié)構(gòu)特征；結(jié)合環(huán)境菌群信息，解析消化道菌群與環(huán)境的關(guān)系，以期為大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中消化道菌群的健康調(diào)控及病害的有效防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚樣本采集與處理

2018年3月23日，在水溫為13℃~16℃的條件下，對寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖的來源于同批苗種的1齡大黃魚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)用魚樣本的采集。其中，工廠化養(yǎng)殖大黃魚體重為(96.13±38.23) g、體長為(20.75±2.98) cm，養(yǎng)殖密度為60尾/m3；網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚體重為(110.21±31.77) g、體長為(21.08±2.98) cm，養(yǎng)殖密度為1.5尾/m3。

消化道樣本：2種養(yǎng)殖模式分別作為2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組分別隨機(jī)挑選6尾大黃魚作為實(shí)驗(yàn)用魚，饑餓處理12 h后，采用MS-222 (Fluka, 美國)麻醉處理。無菌環(huán)境下，采用75%酒精擦拭體表，解剖，提取消化道，分離胃、幽門盲囊和腸道組織，去除內(nèi)容物，采用預(yù)冷的滅菌生理鹽水沖洗各組織，分裝、液氮保存，用于微生物多樣性、消化酶和免疫酶活性分析。

水環(huán)境樣本：分別采集工廠化養(yǎng)殖模式的進(jìn)水口水樣和網(wǎng)箱水樣，每種模式采集3次作為3個(gè)平行樣本，每次通過采水器收集3 L水，采用0.22 μm的濾膜進(jìn)行真空抽濾，濾膜分裝后置于液氮中保存，用于微生物多樣性分析。

飼料樣本：2種模式養(yǎng)殖大黃魚均為1齡魚，投喂的配合飼料完全相同。因此，分別稱取3份0.1 g的配合飼料作為3個(gè)平行樣本，于液氮中保存，用于微生物多樣性分析。

1.2 樣本微生物總DNA提取與高通量測序

將液氮中保存的樣本取出，冰上自然解凍，隨機(jī)選取3條魚的消化道作為平行樣本，每個(gè)消化道組織均勻剪取一部分用于DNA提取，剩余部分用于酶活檢測。采用QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, 德國)試劑盒提取組織樣本和飼料樣本微生物總DNA；采用OMEGA Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, 美國)試劑盒提取處理水樣所得濾膜的微生物總DNA。共27個(gè)生物樣本用于微生物總DNA的提取，具體信息見表1。將通過各試劑盒提取的微生物總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增序列為16s rDNA V3~V4高變區(qū)的序列，選取引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，構(gòu)建文庫，通過Illumina MiSeq PE300平臺進(jìn)行高通量測序。

表1 高通量測序生物樣本信息

Tab.1 The information of biology samples used for high throughput sequencing

1.3 消化道樣本酶活力檢測

將消化道各組織樣本分別稱重，按1∶9(/)比例加入適量預(yù)冷勻漿液，冰浴條件下采用T 10 Basic S25 (IKA, 德國)組織勻漿機(jī)勻漿，4℃5000 r/min離心 30 min，取上清液，作為粗酶提取液，分別按照南京建成的消化酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶)和非特異性免疫酶(酸性磷酸酶ACP、堿性磷酸酶AKP、超氧化物歧化酶SOD、溶菌酶LZM)檢測試劑盒說明書測定酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過高通量測序獲得原始的下機(jī)數(shù)據(jù)，運(yùn)用Trimmomatic (v 0.35)軟件對雙端序列去雜、Flash (v 1.2.11)軟件拼接(overlap的范圍為10~200 bp)、Uchime (v 4.2)去嵌合體序列等一系列處理得到有效序列。采用Vsearch(v 2.4.2)根據(jù)序列的相似性，將相似度≥97%的序列被歸為1個(gè)可操作分類單元(Operational taxonomic units, OTU)，并選取每個(gè)OTU的代表性序列。用RDP Classifer (v 2.2)與Silva數(shù)據(jù)庫(v 123)對OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，保留置信區(qū)間>0.7的注釋結(jié)果。采用tax4fun(0.3.1)對微生物組基因參與的KEGG通路進(jìn)行比對分析。

采用單因素方差分析(One-way ANOVA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Duncan’s檢驗(yàn)對同一養(yǎng)殖模式下大黃魚不同消化道組織間的差異性進(jìn)行多重比較，采用-test檢驗(yàn)對不同養(yǎng)殖模式下大黃魚相同消化道組織進(jìn)行差異性分析，顯著性水平為<0.05。所有數(shù)值均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Means±SE)表示。

2 結(jié)果

本研究共采集27個(gè)生物樣本，經(jīng)高通量測序及對測序數(shù)據(jù)的一系列處理，共獲得916483條Effective tags，經(jīng)歸類操作得到2829個(gè)OTUs。

2.1 大黃魚消化道菌群結(jié)構(gòu)特征

工廠化養(yǎng)殖條件下，大黃魚消化道中幽門盲囊和腸道菌群chao 1指數(shù)(314.44、364.34)和香農(nóng)指數(shù)(6.48、6.23)差異不顯著(>0.05)，但二者均顯著低于胃中菌群的多樣性指數(shù)(<0.05)(表2)。說明，菌群多樣性伴隨大黃魚消化道的延伸整體呈現(xiàn)下降趨勢。

網(wǎng)箱模式下，菌群多樣性指數(shù)同樣隨消化道的延伸整體呈現(xiàn)下降趨勢。但幽門盲囊和腸道菌群chao 1指數(shù)(465.79、327.02)均顯著低于胃中菌群的chao 1指數(shù)(744.64)(<0.05)，而香農(nóng)指數(shù)在消化道各部位間則差異不顯著(>0.05)(表2)。

表2 2種養(yǎng)殖模式大黃魚消化道菌群多樣性

Tab.2 The gastrointestinal microbiota diversity of large yellow croaker cultured in different patterns

注：不同的上標(biāo)小寫字母表示同一養(yǎng)殖模式下消化道不同部位菌群多樣性差異顯著(=3,<0.05)。I1YS、I1YP和I1YG分別表示工廠化模式養(yǎng)殖大黃魚胃、幽門盲囊和腸道樣品；C1YS、C1YP和C1YG分別表示網(wǎng)箱模式養(yǎng)殖大黃魚胃、幽門盲囊和腸道樣品。下同

Notes: Values with different lowercases differ significantly in the same aquaculture pattern for each index (=3,<0.05). I1YS, I1YP and I1YG represent samples from stomach, pyloric caecum and gut of large yellow croaker cultured in industrialized pattern, while C1YS, C1YP and C1YG represent those of large yellow croaker cultured in net cage. The same as below

由表2可以看出，2種養(yǎng)殖模式下大黃魚消化道同一部位間的菌群chao 1和香農(nóng)指數(shù)差異均不顯著(>0.05)。

圖1A為樣本中相對豐度排列前十的優(yōu)勢菌屬。工廠化養(yǎng)殖條件下，大黃魚胃中擬桿菌屬()的相對豐度最高(平均為23.70%)，而在幽門盲囊和腸道中的豐度顯著下降(1.16%~1.32%) (<0.05)；Bacteroidales_S24_7_group(f)、、s、、所代表的菌屬在胃中的豐度均顯著高于其他組織中的豐度(<0.05)(圖1B)。而乳桿菌科(Lactobacillaceae(f))代表的菌屬在幽門盲囊和腸道中為優(yōu)勢菌屬，其相對豐度顯著高于在胃中的豐度(<0.05)；幽門盲囊和腸道中黃桿菌屬()、、醋桿菌科(Acetobacteraceae(f))、E01_9C_26_marine_group (o)等菌屬的豐度均顯著高于在胃中的豐度(<0.05)。可見，工廠化養(yǎng)殖條件下，大黃魚幽門盲囊和腸道中的菌群結(jié)構(gòu)較為相近，與胃部的存在顯著差異。

網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚胃部的最優(yōu)勢菌屬依然是擬桿菌屬(平均豐度為15.68%)，但與工廠化養(yǎng)殖大黃魚相比，其消化道不同部位間優(yōu)勢菌屬差異較小(圖1A和圖1C)。其中，優(yōu)勢菌屬中擬桿菌屬、的相對豐度從胃到腸道逐漸降低，在胃部的豐度顯著高于在腸道中的豐度(<0.05)；醋桿菌科代表的菌屬則呈相反趨勢，腸道中的豐度顯著高于胃和幽門盲囊中的豐度(<0.05)(圖1C)。乳桿菌科、無氧芽孢桿菌屬()、E01_9C_26_marine_group(o)等優(yōu)勢菌屬在消化道不同部位間的豐度接近。

乳桿菌科、、黃桿菌屬、E01_9C_ 26_marine_group(o)、擬桿菌屬、和等所代表的菌屬為2種模式養(yǎng)殖大黃魚消化道共有的優(yōu)勢菌群。其中，擬桿菌屬、和等所代表的菌屬豐度從胃到腸道呈下降趨勢，而乳桿菌科、黃桿菌屬等代表的菌屬則呈相反趨勢(圖1A、圖1B和圖1C)。由圖1D可以看出，不同模式養(yǎng)殖大黃魚消化道同一部位間均存在差異顯著的菌屬(<0.05)。其中，優(yōu)勢菌群中的普氏菌屬(_9)、乳桿菌科代表的菌屬分別在胃和腸道中差異顯著(<0.05)。

A：2種養(yǎng)殖模式下大黃魚消化道各部位優(yōu)勢菌屬組成；B、C：分別為工廠化和網(wǎng)箱模式下大黃魚消化道各部位優(yōu)勢菌屬的豐度特征；D：不同養(yǎng)殖模式下大黃魚同一消化道組織差異菌屬I1YS、I1YP和I1YG分別表示工廠化模式養(yǎng)殖大黃魚胃、幽門盲囊和腸道；C1YS、C1YP和C1YG分別表示網(wǎng)箱模式養(yǎng)殖大黃魚胃、幽門盲囊和腸道。下同

A: The composition of dominant microbiota in gastrointestinal tract for large yellow croaker cultured by two patterns; B and C: The abundances characteristics of dominant microbiota in different gastrointestinal tract tissues of large yellow croaker cultured in industrialized pattern and net cage, respectively; D: The significantly different genera of the same gastrointestinal tract tissue of large yellow croaker cultured in two different aquaculture patterns I1YS, I1YP and I1YG represent stomach, pyloric caecum and gut of large yellow croaker cultured in industrialized pattern, while C1YS, C1YP and C1YG represent those of large yellow croaker cultured in net cage. The same as below

2.2 大黃魚消化道菌群功能特征

通過KEGG分析，在二級水平下，對菌群參與的與營養(yǎng)、免疫功能相關(guān)的環(huán)境信息處理、新陳代謝、器官系統(tǒng)代謝通路的基因數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表3)。綜合對比發(fā)現(xiàn)，消化道中參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)的菌群基因豐度最高(3386400~5409400)，其次為碳水化合物代謝(2542000~3712600)、氨基酸代謝(2153000~3156900)等。工廠化模式下，大黃魚腸道和幽門盲囊中菌群參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝等基因數(shù)目均高于胃部，僅在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)功能方面呈相反趨勢。幽門盲囊和腸道的菌群參與的相關(guān)代謝通路的基因豐度差異不顯著(>0.05)，但是二者與胃部的相關(guān)基因豐度存在顯著差異(<0.05)。網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚消化道菌群參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸代謝、碳水化合物代謝和能量代謝等基因數(shù)目與其他功能相比依然較多，但在消化道各部位間的差異均不顯著(>0.05)。在2種養(yǎng)殖模式的對比中發(fā)現(xiàn)，工廠化養(yǎng)殖大黃魚幽門盲囊中菌群參與循環(huán)系統(tǒng)的基因豐度為5800，顯著高于網(wǎng)箱模式大黃魚的相關(guān)基因豐度(3300)(<0.05)，其他差異均不顯著(>0.05)。

表3 2種模式養(yǎng)殖大黃魚消化道各部位菌群參與各代謝通路的基因豐度

Tab.3 Microbiota gene abundances participating in metabolic pathways in different gastrointestinal tract parts of large yellow croaker cultured in two patterns

注：*表示不同養(yǎng)殖模式下大黃魚消化道同一組織間菌群參與代謝通路的基因豐度差異顯著(=3,<0.05)，不同上標(biāo)小寫字母表示同一養(yǎng)殖模式大黃魚消化道各部位間菌群參與代謝通路的基因豐度差異顯著(=3,<0.05)

Notes: * represents the significant difference between 2 different aquaculture patterns for microbiota gene abundances participating in metabolic pathways of the same large yellow croaker gastrointestinal tract tissue (=3,<0.05). Values with different lowercase represent the significant difference among different gastrointestinal tract tissues of large yellow croaker that cultured in the same pattern for microbiota gene abundances participating in metabolic pathways (=3,<0.05)

2.3 大黃魚消化道菌群與環(huán)境菌群的相關(guān)性

PCA分析中，每一個(gè)點(diǎn)代表了1個(gè)樣本中菌群的組成信息，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離越近表示2樣本間菌群結(jié)構(gòu)較為相近。幽門盲囊與腸道樣本相距較近；與環(huán)境水樣本相比，消化道樣本與餌料樣本相距較近(圖2A)。說明，工廠化養(yǎng)殖大黃魚消化道中幽門盲囊和腸道的菌群組成相似，均與胃部的菌群組成存在較大差異；同時(shí)，3個(gè)部位的菌群組成與飼料中的相關(guān)性較大。以各平行樣本間的共有菌群為基礎(chǔ)，圖2C顯示了工廠化模式下大黃魚消化道與環(huán)境菌群共有及特有菌屬情況，胃與幽門盲囊共有菌屬55個(gè)，占胃中菌屬總量的28.95%；而腸道與幽門盲囊共有菌屬為46個(gè)，占腸道菌屬總量的56.79%；飼料與消化道共有的菌屬數(shù)目占飼料總數(shù)的42.06%，高于與水樣的共有菌屬比例(33.88%)。

圖2 大黃魚消化道菌群與環(huán)境菌群的相似性

A、B分別代表工廠化和網(wǎng)箱模式下的菌群PCA分析；C、D分別代表工廠化和網(wǎng)箱模式下不同樣本間菌群共有分析

A and B represent the principal components analysis (PCA) of gastrointestinal tract microbiota in large yellow croaker cultured by industrialized pattern and net cage, respectively; C and D represent the analysis of shared microbiota among different samples from large yellow croaker cultured by industrialized pattern and net cage, respectively

網(wǎng)箱養(yǎng)殖模式下，大黃魚胃、幽門盲囊、腸道間的菌群組成均相近，并且三者與飼料菌群組成相近(圖2B)。與工廠化養(yǎng)殖情況相似，胃和幽門盲囊共有菌屬75個(gè)，占胃中菌屬總量的45.73%；腸道與幽門盲囊的共有菌屬51個(gè)，占腸道菌屬總量的82.26%；與環(huán)境菌群相關(guān)性分析中，消化道與飼料的共有菌屬比例(38.89%)仍然高于消化道與水的共有菌屬比例(21.02%)(圖2D)。說明，在大黃魚消化道中，幽門盲囊與腸道的菌群組成相近，消化道菌群整體與飼料菌群組成相近。

2.4 大黃魚消化道消化酶和非特異性免疫酶活力特征

工廠化模式養(yǎng)殖大黃魚消化道中，除胰蛋白酶外，其他消化酶活力均高于網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚，工廠化養(yǎng)殖大黃魚幽門盲囊的胃蛋白酶(24.78 U/mg prot)和淀粉酶(0.16 U/mg prot)活力均顯著高于網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚(15.24和0.07 U/mg prot)(<0.05)(表4)。同時(shí)，工廠化養(yǎng)殖大黃魚幽門盲囊和腸道中的淀粉酶活力(0.16和0.14 U/mg prot)顯著高于胃中淀粉酶活力(0.08 U/mg prot)(<0.05)。

整體上，工廠化養(yǎng)殖大黃魚消化道中的包括ACP、AKP、SOD和LZM在內(nèi)的非特異性免疫酶活力高于網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚；除腸道中LZM外，不同養(yǎng)殖模式下相同消化道組織及同一養(yǎng)殖模式不同消化道組織的SOD和LZM活力均差異顯著(<0.05)。

3 討論

3.1 大黃魚消化道菌群特征分析

水產(chǎn)動物易受環(huán)境條件的影響造成自身的不穩(wěn)定，從而影響消化道微生物群。王程程等(2014)對同一養(yǎng)殖海區(qū)的1齡大黃魚的腸道菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腸壁中擬桿菌屬優(yōu)勢度最高。本研究中，擬桿菌屬為大黃魚胃中的優(yōu)勢細(xì)菌，而在腸道中其豐度僅為0.88%~1.32%，這可能是取樣時(shí)間不同造成的環(huán)境條件差異引起的，當(dāng)然也有來自魚體自身的差異。在同一取樣時(shí)間，對來源于同一養(yǎng)殖場繁育的0齡大黃魚消化道菌群特征進(jìn)行研究，發(fā)光桿菌屬()、弧菌屬()、乳桿菌屬()等為2種模式養(yǎng)殖大黃魚消化道的共有優(yōu)勢菌群，而假單胞菌屬()、氣單胞菌屬()和為主要差異菌屬(姜燕等, 2019)。然而，本文中對1齡大黃魚消化道菌群的研究卻發(fā)現(xiàn)，乳桿菌科、和黃桿菌屬等所代表的菌屬為2種模式養(yǎng)殖大黃魚消化道共有的優(yōu)勢菌群，其中，擬桿菌屬、黃桿菌屬和普氏菌屬_9為0齡和1齡大黃魚消化道共存的優(yōu)勢菌屬；2種模式的大黃魚消化道差異菌屬則不存在共有情況。這也反映出魚體的生理階段、生存環(huán)境等均可對消化道菌群結(jié)構(gòu)特征形成一定的影響(Banerjee, 2017; Jiang, 2019a; Kelly, 2010; Shabat, 2016; Sullam, 2012; Zhang, 2016)。同時(shí)也說明，魚體自身及其生存環(huán)境對其消化道菌群存在影響，但一些主要菌群依然定植于消化道。Jiang等(2019a、b)在對牙鲆()和大菱鲆()早期生長階段消化道菌群結(jié)構(gòu)特征和演替的研究中發(fā)現(xiàn)，從1日齡仔魚開始，經(jīng)過生物餌料(輪蟲、鹵蟲)期，至顆粒餌料穩(wěn)定期，同樣存在一些共有菌屬始終以優(yōu)勢菌群的地位定植于消化道中。可見，每種魚都有幾個(gè)優(yōu)勢菌屬始終定植于消化道。

表4 不同模式養(yǎng)殖大黃魚消化道各部位消化酶和非特異性免疫酶活力

Tab.4 The activity of digestive and nonspecific immunity enzyme of the gastrointestinal tract of large yellow croaker cultured in different patterns

注：*表示大黃魚消化道同一組織不同養(yǎng)殖模式間酶活力差異顯著(=3,<0.05)，不同上標(biāo)小寫字母表示同一養(yǎng)殖模式大黃魚消化道各部位間酶活力差異顯著(=3,<0.05)

Notes: * represents the significant difference between different aquaculture patterns for enzyme activity of the same gastrointestinal tract tissue of large yellow croaker (=3,<0.05). Values with different lowercase represent the significant difference among different gastrointestinal tract tissues of large yellow croaker for enzyme activity that cultured in the same pattern (=3,<0.05)

不同養(yǎng)殖模式對魚類消化道菌群結(jié)構(gòu)特征具有一定影響。在池塘與工廠化養(yǎng)殖模式的對比中發(fā)現(xiàn)，池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群多樣性高于工廠化養(yǎng)殖牙鲆，且優(yōu)勢菌屬中的芽孢桿菌屬和弧菌屬的豐度在2種養(yǎng)殖模式下差異顯著(李存玉等, 2015)。Wang等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)箱和養(yǎng)殖池養(yǎng)殖的羅非魚()腸道菌群存在一定差異。本研究中，詳細(xì)對比各優(yōu)勢菌屬分別在2種模式養(yǎng)殖大黃魚消化道不同部位間的顯著性差異，而且還針對工廠化和網(wǎng)箱養(yǎng)殖模式下大黃魚消化道每一個(gè)部位間的差異菌屬進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)幽門盲囊和腸道的菌屬組成相似，二者與胃的菌屬差異較大，并且工廠化條件下的差異相對明顯。同時(shí)，普氏菌屬、乳桿菌科代表的菌屬為2種模式養(yǎng)殖大黃魚的主要差異菌屬。推測，這可能與養(yǎng)殖魚類自身特性及其養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)。同時(shí)，水和餌料是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中必不可少的兩大外部要素，對養(yǎng)殖動物或消化道的菌群結(jié)構(gòu)具有一定的影響 (De Schryver, 2010; Bakke, 2013; Li, 2017; 劉增新等, 2017; 何嬌嬌等, 2018; Jiang, 2018)。本研究發(fā)現(xiàn)，與養(yǎng)殖水體相比，養(yǎng)殖大黃魚消化道菌群結(jié)構(gòu)與飼料菌群結(jié)構(gòu)更相近，而2種養(yǎng)殖模式的大黃魚采用同種飼料投喂，且2種養(yǎng)殖模式大黃魚的消化道菌群結(jié)構(gòu)存在一定的差異，這可能與養(yǎng)殖模式不同造成的環(huán)境差異相關(guān)。

3.2 大黃魚消化道菌群功能分析

消化道是營養(yǎng)代謝的主要場所，而菌群對宿主營養(yǎng)相關(guān)功能方面發(fā)揮著重要作用(Cantarel, 2009; Flint, 2012; Ray, 2012; Semova, 2012)。在反芻動物的研究中顯示，消化道菌群在能量代謝方面能夠協(xié)同宿主更好地適應(yīng)生存環(huán)境(Shabat, 2016; Zhang, 2016)。本研究中，結(jié)合2種模式下大黃魚消化道各部位菌群結(jié)構(gòu)特征分析，發(fā)現(xiàn)菌群功能與結(jié)構(gòu)呈正相關(guān)關(guān)系。工廠化條件下，大黃魚胃部菌群功能與幽門盲囊和腸道菌群功能差異顯著，而網(wǎng)箱條件下該差異減弱，并且二級水平下2種模式間的菌群功能差異不顯著。推測，這可能與工廠化條件下養(yǎng)殖密度較高有關(guān)。在與營養(yǎng)相關(guān)的代謝功能中，與參與其他代謝通路的基因豐度相比，消化道各部位菌群參與碳水化合物代謝、氨基酸代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝等的基因數(shù)目相對較高，說明，菌群主要參與了大黃魚對營養(yǎng)消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的過程。這與不同模式養(yǎng)殖0齡大黃魚的消化道菌群功能研究結(jié)果相似(姜燕等, 2019)。

另外，消化道菌群能夠通過產(chǎn)物抑制等競爭性作用阻止外源微生物的入侵，有效提高宿主的免疫功能(Tagg, 1976; Noonpakdee, 2003; Qian, 2007; Chen, 2010)。本研究中，大黃魚消化道菌群中參與免疫相關(guān)功能的基因數(shù)目與其他功能的基因數(shù)相比較少，并且不同部位間差異不顯著，這可能與實(shí)驗(yàn)魚處于健康狀態(tài)、菌群基因主要富集在與營養(yǎng)相關(guān)的代謝通路中相關(guān)。

3.3 大黃魚消化道消化酶和非特異性免疫酶活力分析

攝入體內(nèi)的食物消化主要依賴于消化腺和消化器官分泌的消化酶，而消化酶活力受生存環(huán)境、pH、魚體生理階段、魚種類、食性和營養(yǎng)水平等多種因素的影響(趙志剛等, 2017; 王常安等, 2017; 楊婳等, 2014; 周景祥等, 2001)。而消化酶活力的大小則代表消化能力的強(qiáng)弱。研究指出，有胃魚類特別是肉食性魚類，攝入體內(nèi)的蛋白主要在胃中進(jìn)行消化(周景祥等, 2001)。腸道中的蛋白酶主要來源于腸粘膜、肝胰臟、幽門垂等分泌的胰蛋白酶(王海英, 2004)。魚類的各消化器官均存在淀粉酶，而幽門盲囊中一般不存在脂肪酶(李瑾等, 2001)。而相關(guān)報(bào)道指出，大菱鲆、亞東鮭()等的幽門盲囊具有相對較高的脂肪酶活力(王海英, 2004; 王常安等, 2017)。本研究中，通過對比也發(fā)現(xiàn)，蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶存在于消化道的各部位。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能與魚的食性、生存環(huán)境等相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，除胰蛋白酶外，工廠化養(yǎng)殖的大黃魚消化道各消化酶活力均高于網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚，可能與工廠化條件下養(yǎng)殖密度較高及定植于消化道內(nèi)壁的菌群結(jié)構(gòu)相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，消化道中的胃和幽門盲囊均具有相對較高的ACP、AKP、SOD和LZM活力，說明，大黃魚的整個(gè)消化道不僅具有微生物免疫屏障作用，而且還具有一定的化學(xué)免疫屏障作用。相關(guān)報(bào)道指出，攝食和生存環(huán)境因子等均可在一定程度上影響魚類的免疫酶活力(Liu, 2017; Zhang, 2012; 卓麗欣等, 2018)。相對于工廠化模式，網(wǎng)箱養(yǎng)殖密度相對較低，養(yǎng)殖環(huán)境相對開放，這些因素綜合導(dǎo)致工廠化養(yǎng)殖大黃魚提高自身的非特異性免疫酶活力來適應(yīng)生存環(huán)境。因此，本研究中，魚類整個(gè)消化道都存在ACP和SOD等非特異性免疫酶，工廠化養(yǎng)殖條件下，魚的非特異性免疫酶活力高于網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚，推測與養(yǎng)殖密度和養(yǎng)殖模式相關(guān)。王孝杉等(2018)對放養(yǎng)密度基本一致的循環(huán)水和網(wǎng)箱模式養(yǎng)殖黃姑魚的生長、免疫、血清生化等指標(biāo)進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)循環(huán)水系統(tǒng)對黃姑魚的脅迫大于網(wǎng)箱系統(tǒng)。然而，密度脅迫可能會導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類體內(nèi)免疫酶活性的降低，并影響魚類的生長(薛寶貴等, 2013; Barcellos, 2004)。

4 結(jié)論

通過對比分析，明確了大黃魚消化道共有的優(yōu)勢菌群為乳桿菌科、、黃桿菌屬、E01_9C_ 26_marine_group(o)、擬桿菌屬、和等所代表的菌屬。工廠化模式養(yǎng)殖大黃魚消化道各組織間菌群結(jié)構(gòu)與功能存在一定差異， 2種模式養(yǎng)殖大黃魚消化道菌群與飼料菌群更相近。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，大黃魚整個(gè)消化道均具有一定的非特異性免疫酶活性，不同分組間的消化酶和免疫酶活力存在一定差異。

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Analysis of Microbiota Structure, Digestive Enzyme and Nonspecific Immune Enzyme Activity in the Gastrointestinal Tract of Large Yellow Croaker

JIANG Yan1,2, XU Yongjiang2, YU Chaoyong3, LIU Xuezhou1,2①, WANG Bin2, ZHENG Weiqiang1, GUAN Shuguang3, SHI Bao2, CHEN Jia1, KE Qiaozhen1

(1. State Key Laboratory of Large Yellow Croaker Breeding, Ningde Fufa Fisheries Co. Ltd., Ningde 352103; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 3. Marine Biology Institute of Shandong Provincial, Qingdao 266104)

The aim of this project was to investigate the characteristics of the microbiota structure and the activity of digestive and nonspecific immune enzymes in the gastrointestinal tract of large yellow croaker (). We systematically analyzed the composition and distribution of microbiota in the stomach, pyloric caecum, and gut of large yellow croaker using high-throughput sequencing. Moreover, we conducted comparative analysis of the gastrointestinal tract microbiota in large yellow croakers cultured via the industrialized or net cage culture pattern. Under these two aquaculture patterns, we analyzed the activity of digestive and nonspecific immune enzymes in the gastrointestinal tract through biochemical methods. The microbiota diversity in the gastrointestinal tract declined under both aquaculture patterns. The genera including Lactobacillaceae(f),and, and etc, were the shared and dominant microbiota. The abundances ofanddeclined from the beginning of the gastrointestinal tract to the end, while those ofand genera represented by Lactobacillaceae (f) and the E01_9C_26_marine_group increased under both aquaculture patterns. Genera belonging to9 and Lactobacillaceae(f) were the main different species between these two aquaculture patterns. Under the industrialized pattern, the composition of microbiota and number of genes involved in metabolic pathways associated with nutrition and immunity were not significantly different between the pyloric caecum and gut (>0.05), while these values obviously different from those in the stomach. In contrast, under net cage culture, differences between the stomach and pyloric caecum or gut decreased. The microbiota composition of the gastrointestinal tract of large yellow croakers cultured with these two patterns was similar to that of the feed. Additionally, the stomach and pyloric caecum exhibited nonspecific immune enzyme activities, indicating that the entire gastrointestinal tract functions as a chemical immune barrier. These results can serve as a basis for healthy large yellow croaker cultures and provide a theoretical foundation for studying the physiological functions of the gastrointestinal tract microbiota.

Large yellow croaker; Gastrointestinal tract; Microbiota; Digestive enzymes; Nonspecific immune enzymes; Culture mode

LIU Xuezhou, E-mail: liuxz@ysfri.ac.cn

S917.1

A

2095-9869(2020)05-0008-12

10.19663/j.issn2095-9869.20190515002

http://www.yykxjz.cn/

姜燕, 徐永江, 于超勇, 柳學(xué)周, 王濱, 鄭煒強(qiáng), 官曙光, 史寶, 陳佳, 柯巧珍. 大黃魚消化道菌群結(jié)構(gòu)、消化酶和非特異性免疫酶活力分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(5): 61–72

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* 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院院級基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2019GH15)、大黃魚育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題基金(LYC2017RS01)、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(CARS-47)、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(20603022018021)、中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)(2017L3019)和福建省科技平臺建設(shè)項(xiàng)目(2018N2005)共同資助[This work was supported by Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2019GH15), Open Research Fund Project of State Key Laboratory of Large Yellow Croaker Breeding (LYC2017RS01), China Agriculture Research System (CARS-47), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS (20603022018021), the Local Science and Technology Development Project Guide by Central Government (2017L3019), and Science and Technology Platform Construction of Fujian Province (2018N2005)]. 姜 燕，E-mail：jiangyan@ysfri.ac.cn

柳學(xué)周，研究員，E-mail：liuxz@ysfri.ac.cn

2019-05-15,

2019-07-11

(編輯 馬璀艷)