陸鍵萍 姚 琳 信紅梅,3 曲 夢 江艷華 李風(fēng)鈴 郭瑩瑩 王聯(lián)珠 許加超

線粒體Ⅰ、b和16S rRNA基因在6種金槍魚鑒定中的適用性分析*

陸鍵萍1,2姚 琳2信紅梅2,3曲 夢2江艷華2李風(fēng)鈴2郭瑩瑩2王聯(lián)珠2①許加超1①

(1. 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 青島 266000；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室 青島 266071；3. 大連工業(yè)大學(xué) 大連 116000)

探討細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ基因(Ⅰ)、細(xì)胞色素b基因(b)及16S rRNA基因?qū)χ饕獫O獲區(qū)的藍鰭金槍魚()、馬蘇金槍魚()、黃鰭金槍魚()、大目金槍魚()、長鰭金槍魚()和正鰹() 6種重要的生食金槍魚及其易混品種的物種鑒定和進化分析的適用性。采用3對通用引物對6種金槍魚共63個樣品的Ⅰ、b和16S rRNA 3種序列片段進行PCR擴增、測序，并運用DnaSP 5.10、Mega 7.0等軟件進行了DNA序列分析、遺傳差異分析和進化樹分析。結(jié)果顯示，16S rRNA較為保守，不能很好區(qū)分6種金槍魚，且不能對同一物種不同地理群體進行聚類分析；b和Ⅰ配合使用能很好區(qū)分6種金槍魚，且存在一定同一物種地理群體聚類的趨勢。建議Ⅰ與b基因聯(lián)合用于上述6種金槍魚的分子鑒別研究。本研究為生食金槍魚及其制品的物種鑒定及金槍魚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供了技術(shù)支撐。

金槍魚；分子鑒定；Ⅰ；b；16S rRNA

金槍魚是棲息在大洋上層的大型魚類，具有高度洄游的特性，在世界漁業(yè)中占有重要的地位(戴小杰等, 2007)。從漁業(yè)利用角度講，金槍魚一般指經(jīng)濟價值較大的藍鰭金槍魚()、馬蘇金槍魚()、黃鰭金槍魚()、大目金槍魚()、長鰭金槍魚()和正鰹()等(徐坤華等, 2014)，其中，藍鰭、馬蘇、黃鰭和大目金槍魚等主要用于生魚片的加工，長鰭金槍魚和正鰹等小型金槍魚主要作為金槍魚罐頭和日本“木魚”(Katsuobushi)原料(方健民等, 2006)。不同品種金槍魚價格差異很大，尤其是其去頭去皮的銷售方式，導(dǎo)致金槍魚市場上標(biāo)簽錯亂和以次充好的問題尤為嚴(yán)重，損害了消費者利益，破壞了正常的經(jīng)營秩序；由于市售金槍魚及其制品均缺少失主要的形態(tài)學(xué)鑒定特征，因此，金槍魚及其制品的分子鑒定方法成為國內(nèi)外的研究熱點。

DNA條形碼是物種分子鑒定研究中的重要方法，美國FDA(Food and Drug Administration)也將其作為食品標(biāo)簽認(rèn)證的方法(王敏等, 2015; Karim, 2016)，彌補了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法的不足。Barrett等(2005)最早提出DNA條形碼的定義，且最先以細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ基因(Ⅰ)為研究對象。Ⅰ基因具有足夠的遺傳變異信息，廣泛用于魚類的鑒定和分類(Hanner, 2011; Khedkar, 2014)。隨著基因條形碼技術(shù)的發(fā)展，除了Ⅰ基因序列作為標(biāo)準(zhǔn)條形碼外，作為重要條形碼的細(xì)胞色素b基因(b)、16S rRNA和線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅱ基因(Ⅱ)等，近年也越來越多地被應(yīng)用于物種鑒定和遺傳多樣性分析(Chapela, 2005; 崔文濤等, 2013)。b能在同一物種內(nèi)表現(xiàn)出穩(wěn)定的遺傳性，卻在不同物種間具有明顯的遺傳差異，因此，被用于物種種屬鑒定(Becker, 2015)；線粒體16S rRNA既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，已成為廣泛應(yīng)用于水生動物群體遺傳多樣性和系統(tǒng)進化分析研究的分子標(biāo)記(孫超等, 2014; 陳文炳等, 2017)。

本研究以主要生食金槍魚及其易混品種(藍鰭、馬蘇、黃鰭、大目、長鰭金槍魚和正鰹)為研究對象，利用Ⅰ、b和16S rRNA基因?qū)ζ溥M行DNA條形碼研究、遺傳差異分析和進化樹分析，探討3種基因在金槍魚分子鑒定研究中的適用性，為生食金槍魚的物種鑒定及金槍魚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 長鰭金槍魚(組編號：CQ，下同)、黃鰭金槍魚(HQ)、藍鰭金槍魚(LQ)、馬蘇金槍魚(MS)、大目金槍魚(DM)、正鰹(JY)肌肉組織共63份，每份均來自于捕撈地點、外形特征明確的金槍魚個體，如表1所示，由本實驗室收集保存。

表1 樣品信息及編號

Tab.1 Sample information and number

1.1.2 試劑與儀器 TIANGEN海洋動物組織DNA提取試劑盒、2×PCR Master Mix和DL2000 DNA marker購自天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純；引物合成及序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；PCR儀為T1常規(guī)PCR儀(德國Whatman Biomerra公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)Infinity 3000(法國Vilber Lourmat公司)，核酸蛋白測定儀NanoPhotometer Pearl(德國Implen公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及PCR擴增 取30 mg魚肉，剪碎后置于離心管中，按照試劑盒說明書提取DNA，用核酸蛋白測定儀測定DNA濃度和純度，–20℃保存。本實驗選取引物見表2，PCR反應(yīng)體系見表3。PCR反應(yīng)程序為：95℃ 10 min；94℃ 1 min，52℃或53℃1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。

表2 引物信息

Tab.2 Information of primers

表3 PCR擴增體系

Tab.3 PCR amplification system

將PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄實驗結(jié)果；PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

1.2.2 序列比對與建樹分析 測序結(jié)果經(jīng)人工校對后去除引物區(qū)，在NCBI網(wǎng)站上通過BLAST分析將測序結(jié)果與GenBank中參考序列比對分析，其中，Ⅰ基因采用BOLD(Barcode of Life Data System生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)www.boldsystems.org)進行分析；通過DnaSP 5.10軟件計算其二者序列的單倍型數(shù)()、單倍型多樣性指數(shù)(H)、平均核苷酸差異數(shù)()、核苷酸多樣性指數(shù)()等遺傳多樣性參數(shù)。運用Mega 7.0軟件，統(tǒng)計序列堿基組成，計算序列保守位點(C-conserved sites)、簡約信息位點(PI-parsimony- informative sites)和變異位點(V-variable sites)，并采用鄰接法(Neighbor joining, NJ)法，自展檢驗1000次，采用Kimura 2-parameter模型，以牛(,GenBank：KM233416)線粒體DNA(mtDNA，包含Ⅰ、b和16S rRNA基因)作為外類群，同時在NCBI網(wǎng)站選取6種金槍魚mtDNA(GenBank: AB101291;GenBank: JN086153;GenBank: KF925362;GenBank: GU256525;GenBank: KF906720;GenBank: KM605252)作為標(biāo)準(zhǔn)基因，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增

長鰭金槍魚等63個實驗樣本均擴增出單一的片段，未發(fā)現(xiàn)其片段長度多態(tài)性，測序得到片段大小分別為Ⅰ652 bp、b 307 bp、16S rRNA 576 bp(圖1)，與預(yù)期一致。

M：DNA marker；1：長鰭金槍魚；2：藍鰭金槍魚；3：大目金槍魚； 4：黃鰭金槍魚；5：馬蘇金槍魚；6：鰹魚；7：空白對照

M: DNA marker; 1:; 2:;3:; 4:; 5:; 6:; 7: Blank control

2.2 基因序列

3種基因擴增產(chǎn)物序列經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫比對，確定位于mtDNA 16S rRNA、Ⅰ、b區(qū)域，BLAST結(jié)果和BOLD比對結(jié)果與各樣本來源魚的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

經(jīng)人工校正去除上下游引物，得到Ⅰ、b和16S rRNA基因片段中T、C、A和G平均含量(表4)，其中，16S rRNA基因中A+T平均含量為52.7%，稍高于G+C平均含量(47.3%)，且6種金槍魚的GC含量差異不大；其中，Ⅰ基因中A+T平均含量為53.0%，稍高于G+C平均含量(47.0%)，且6種金槍魚的GC含量差異不大；其中，b基因A+T平均含量為51.9%，稍高于G+C平均含量(48.1%)，且6種金槍魚相互間的GC含量差異也不大。3種基因的GC含量在47.0%~48.1%之間，其中，b基因GC含量最高(48.1%)。

表4 6種金槍魚Ⅰ、b和16S rRNA基因堿基組成

Tab.4 Base composition of COⅠ, Cyt b and 16S rRNA genes in six tuna species

各項遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計如表5所示?；?6S rRNA序列的金槍魚各物種變異位點(V)為12，變異率僅為2.08%，遠小于Ⅰ(11.35%)、b(15.96%)。16S rRNA序列轉(zhuǎn)換/顛換比()為1.49，也小于Ⅰ(2.50)和b(2.48)。從平均核苷酸差異數(shù)()和核苷酸多樣性指數(shù)()來看，16S rRNA是3種基因中最小的，而保守位點所占比率為97.92%，是3種基因中最保守的，說明了該核苷酸變異程度較低，表明了遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。

基于b序列的金槍魚各物種的變異位點(V)為49，小于Ⅰ(71)，但其變異率為15.96%，高于Ⅰ變異率(11.35%)。b序列的單倍型多樣性指數(shù)(H)低于Ⅰ，平均核苷酸差異數(shù)()低于Ⅰ，而核苷酸多樣性指數(shù)()卻是3種基因片段中最高的，說明較之16S rRNA和Ⅰ序列，b序列核苷酸變異程度最高，遺傳多樣性較高，分化程度要比其余二者高，但其遺傳多樣性沒有Ⅰ序列高，Ⅰ序列遺傳資源較豐富。

表5 3種基因片段的遺傳多樣性參數(shù)

Tab.5 Genetic diversity parameters of three gene fragments

注：：保守位點；PI：簡約信息位點；：變異位點；：轉(zhuǎn)換/顛換比；：單倍型數(shù)；H：單倍型多樣性指數(shù)；：平均核苷酸差異數(shù)；：核苷酸多樣性指數(shù)

Note:: Conserved sites; PI: Parsimony-informative sites;: Variable sites;: Transitions/transversions ratio;: Number of haplotypes;H: Haplotype diversity;: Average number of nucleoside difference;: Nucleotide diversity

2.3 系統(tǒng)進化樹

2.3.1 16S rRNA 基于16S rRNA基因構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進化樹見圖2。圖2顯示，6種金槍魚分為4大支，黃鰭金槍魚(HQ)與大目金槍魚(DM)聚為一支。藍鰭金槍魚(LQ)與馬蘇金槍魚(MS)聚為一支，其中3條標(biāo)準(zhǔn)序列(JN086153)，(KF906720)和(GU256525)聚為一小支，與(KF925362)共同在這一大支下。長鰭金槍魚(CQ)和(AB101291)的遺傳差異與上述4種金槍魚較大，單獨聚為一支。鰹魚(JY)和(KM605252)單獨歸為一大支，且和上述5種金槍魚屬遺傳距離最遠，親緣關(guān)系也最遠。這一結(jié)果表明，16S rRNA基因只能單獨區(qū)分出長鰭金槍魚和鰹魚，不能很好區(qū)分黃鰭、大目、藍鰭與馬蘇金槍魚，而且不能對同一物種不同地理群體進行聚類分析。16S rRNA基因序列相對較為保守，6種金槍魚的遺傳距離較為接近，遺傳差異較小。

2.3.2Ⅰ 基于Ⅰ基因構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進化樹見圖3。圖3顯示，6種金槍魚分為6大支，大西洋大目(dd)、太平洋大目(dt)和印度洋大目(dy)以及(GU256525)歸為一大支，雖然可以看出有地理群體聚類的趨勢(dd-21、dd-25和dd-27聚為一小支等)，但也存在混雜不同地理群體大目金槍魚的問題(dy和dt相互參雜，dd-30與它們在同一分支下)。雖然藍鰭金槍魚(LQ)和(KF906720)與馬蘇金槍魚(MS)遺傳距離較為接近，但明顯單獨成為一支。印度洋馬蘇(my)和養(yǎng)殖馬蘇(ms)以及(KF925362)歸為馬蘇金槍魚(MS)一大支，但無法從進化樹當(dāng)中明顯看出二者因地理位置導(dǎo)致的遺傳差異。除了huy-16的其他印度洋黃鰭(huy)、大西洋黃鰭(hud)和太平洋黃鰭(hu)以及(JN086153)歸為黃鰭金槍魚(HU)一大支，三者同樣無法從進化樹當(dāng)中看出明顯的因地理位置導(dǎo)致的遺傳差異。huy-16進化分支地位與HQ、DM、MS和LQ四者并列，這一個體單獨成一支。南太平洋長鰭(chq)和美國長鰭(cm)以及(AB101291)歸為長鰭金槍魚(CQ)一大支，同樣無法從進化樹明顯看出二者因地理位置導(dǎo)致的遺傳差異。鰹魚(JY)和(KM605252)單獨歸為一大支，且和上述5種金槍魚遺傳距離最遠，親緣關(guān)系也最遠。結(jié)果表明，Ⅰ基因能較好區(qū)別6種金槍魚，其進化速率與16S rRNA基因相比較快，遺傳信息較為豐富。

2.3.3b基于b基因構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進化樹見圖4，其建樹結(jié)果與Ⅰ建樹結(jié)果大體一致。不同的是，樣品huy-16在b建樹結(jié)果中歸為黃鰭金槍魚(HU)一大支，且b基因建樹結(jié)果存在一定程度的地理群體聚類的趨勢(dd-21、dd-25和dd-27聚為一小支等)，但總體而言，無法從進化樹中明顯看出同種金槍魚因地理位置導(dǎo)致的遺傳差異。結(jié)果表明，相比于16S rRNA和Ⅰ基因，b基因?qū)τ?種金槍魚的區(qū)分最為準(zhǔn)確，基因分化程度較高，區(qū)分度較好。

3 討論

隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，物種鑒定的研究方法已從形態(tài)學(xué)、生理生化水平發(fā)展到分子水平，鑒定的依據(jù)從形狀、大小、顏色和解剖特征等方面，發(fā)展到DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子層面(蔣守富等, 2014; 柳淑芳等, 2016)?；贒NA開發(fā)的多種分子鑒定方法，已廣泛應(yīng)用于金槍魚及其易混物種的鑒定中。Liu等(2016)采用實時熒光PCR技術(shù)成功鑒定了馬蘇、大目、黃鰭、長鰭和正鰹等金槍魚；Lin等(2008)建立了多重PCR方法，用來區(qū)分鰹()、圓舵鰹()、扁舵鰹()、東方狐鰹()和鮪()等5種小型金槍魚；Abdullah等(2016)運用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-strand conformation polymorphism, SSCP)方法將圓舵鰹從金槍魚屬中鑒定出來。近年來，微衛(wèi)星(Simple sequence repeats, SSRs)分子標(biāo)記技術(shù)越來越多地應(yīng)用于物種的鑒定和遺傳多樣性研究，邱凡等(2008)運用RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記)和微衛(wèi)星技術(shù)對比分析了太平洋藍鰭金槍魚野生群體的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星與RAPD相比能更好更完善地揭示群體的遺傳多樣性；Riccioni等(2010)采用微衛(wèi)星技術(shù)分析了大西洋藍鰭金槍魚從20世紀(jì)初到2007年的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)大西洋藍鰭金槍魚在空間和時間上保留了高水平的遺傳多樣性，為藍鰭金槍魚的鑒定研究奠定基礎(chǔ)。上述技術(shù)手段能對特定范圍內(nèi)的金槍魚進行鑒定，但也在不同程度上存在操作繁瑣、鑒定時間長、成本較高等不足。

DNA條形碼是分子鑒定研究中的主要方法，具有很多優(yōu)點：基本不受樣品組織形態(tài)的影響；不受樣品生命周期的限制；通過基因測序鑒定，準(zhǔn)確性高；操作簡便，成本低；效率高，可快速鑒定大量樣本；可幫助無專業(yè)分類學(xué)知識的人獲得物種信息(律迎春等, 2011)。理想的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼片段并不局限于Ⅰ基因序列，能有效鑒定物種的DNA片段都可以應(yīng)用。此外，多基因遺傳信息的組合使用，能獲得更理想的物種系統(tǒng)進化分析結(jié)果(Aoyama, 2001)。針對金槍魚采用多基因片段組合使用的鑒定方法已成為目前的關(guān)注重點，Neils等(2015)利用Ⅰ和1(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔1區(qū))基因成功識別了地中海的3個產(chǎn)卵區(qū)的藍鰭金槍魚幼體；Lowenstein等(2009)采用多條Ⅰ基因引物鑒定68種金槍魚壽司樣本，其中的22個樣本商品標(biāo)簽與實際物種信息不符，顯示了多基因組合使用的思路在金槍魚物種分子鑒定領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。鄰接法、最大似然法(Maximum likelihood, ML)和最大簡約法(Maximum parsimony, MP)是目前構(gòu)建系統(tǒng)進化樹的主要方法。其中，NJ法是基于最小進化原理常用的一種算法，具有重建的樹相對準(zhǔn)確、假設(shè)少、計算速度快等優(yōu)點。故NJ法適用于進化距離不大，信息位點少的短序列，廣泛用于鱈魚、鯧魚和銀魚等遺傳進化分析。

本研究以主要漁獲海域的6種金槍魚及其易混種為研究對象，采用Ⅰ、b和16S rRNA基因序列作為DNA條形碼進行進化分析，探討多基因條形碼在金槍魚鑒定研究中的適用性。從實驗數(shù)據(jù)來看，16S rRNA基因序列變異率僅為2.08%，遠小于Ⅰ(11.35%)、b(15.96%)，且其他遺傳多樣性參數(shù)也是3種序列中最小的；從建樹結(jié)果來看，16S rRNA基因并不能完全區(qū)分出6種金槍魚，只能鑒定出長鰭金槍魚和鰹魚，不能區(qū)分黃鰭和大目金槍魚，也不能區(qū)分藍鰭與馬蘇金槍魚，更不能獲得同一物種因地理位置導(dǎo)致的遺傳差異。結(jié)果表明，Ⅰ和b基因的進化速率較16S rRNA基因快，16S rRNA則相對保守，這在狹鱈()、太平洋鱈()等4種鱈魚的遺傳分析上也有類似結(jié)果(畢瀟瀟等, 2009)。

單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)是衡量一個物種群體多樣性的非常重要的指標(biāo)(Vrijenhoek, 1994)。單倍型多樣性指數(shù)是群體變異程度的重要指標(biāo)，單倍型多樣度高的群體說明其遺傳多樣性高，遺傳資源豐富；而核酸多樣性指數(shù)小，說明核苷酸變異程度較低，表明了遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。b序列的單倍型多樣性指數(shù)(H)和平均核苷酸差異數(shù)()均低于Ⅰ，而核苷酸多樣性指數(shù)()卻高于Ⅰ，說明金槍魚中b基因較Ⅰ基因序列變異速率快，這與鯧屬()魚類、波紋唇魚()和大銀魚()中的規(guī)律相似(孫鵬等, 2011; 胡靜等, 2014; 李大命等, 2017)。相比之下，Ⅰ基因序列進化速率較慢，且比b擁有更多系統(tǒng)發(fā)育信息，更適合解析親緣關(guān)系密切的分類類群(莫幫輝等, 2008)。相比而言，b進化速度適中，可以用于分析物種種內(nèi)，甚至種屬科間的進化遺傳信息，有較強的適用性(辛翠娜等, 2009)。從建樹結(jié)果來看，針對huy-16樣本，b序列建樹結(jié)果將huy-16歸為黃鰭金槍魚(HQ)這一大支；而Ⅰ序列建樹結(jié)果顯示，該樣本單獨歸為一支，獨立于黃鰭、馬蘇、藍鰭和大目金槍魚之外，無法成功鑒定該樣品。關(guān)于樣品huy-16，16S rRNA和b序列建樹結(jié)果都顯示為黃鰭金槍魚，而該樣本來源經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，確屬黃鰭金槍魚，而從Ⅰ序列建樹結(jié)果并未得出這一結(jié)論，所以從該角度來看，b序列建樹結(jié)果要比Ⅰ序列建樹結(jié)果要準(zhǔn)確。Ⅰ、b和16S rRNA 3種基因都無法從進化樹中看出同種金槍魚因地理位置導(dǎo)致的遺傳差異，無法進行同一物種不同地理群體的聚類分析，但Ⅰ與b在一定程度上體現(xiàn)了地理聚類趨勢，可作為群體遺傳進化研究的輔助參考。

目前，國內(nèi)外研究多采用Ⅰ基因作為魚類分子鑒定及進化分析的目標(biāo)基因，也有學(xué)者認(rèn)為，如果僅以一種基因作為參考序列，有可能導(dǎo)致鑒定結(jié)果發(fā)生偏差，因此，建議同時使用多種基因進行研究(Page, 2010; Krück, 2013)，這一觀點已在石斑魚和河鲀中得到證實(陳雙雅等, 2012; 李楠等, 2018)。本研究結(jié)果進一步表明，對金槍魚這種大洋性魚類，不宜單獨使用單一基因作為鑒定依據(jù)，建議Ⅰ序列與b序列聯(lián)合用于金槍魚及其制品的物種鑒定研究。

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Applicability Analysis of MitochondrialⅠ,b and 16S rRNA Genes in Identification of Six Tuna Species

LU Jianping1,2, YAO Lin2, XIN Hongmei2,3, QU Meng2, JIANG Yanhua2, LI Fengling2, GUO Yingying2, WANG Lianzhu2①, XU Jiachao1①

(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266000;2. Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071;3. School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116000)

Tuna is rich in nutrients and one of three major fish recommended by the International Nutrition Society. Large tuna such as,,andare used as top-grade aquatic products, mainly in the form of sushi or other fresh fish products. Small tuna such asandare mainly used in canned tuna and processed katsuobushi. The price of different species of tuna varies greatly, especially because selling tuna without the head or skin can lead to mislabeling and substandard products, which harms the interests of consumers and undermines market functions. This study was aimed at the identification,,,,andUsing tuna DNA as a template, three pairs of universal primers were used to amplify and sequence the DNA fragments of three genes (16S rRNA,b, andⅠ) from six species of tuna. The sequencing results were manually corrected to remove the primer regions, which were compared with reference sequences in GenBank by BLAST analysis on the National Center for Biotechnology Information website. TheⅠ gene was analyzed by the Barcode of Life Data System (www.boldsystems.org). As a result, DNA sequences of 16S rRNA (576 bp),b(652 bp) andⅠ (307 bp) were obtained from 63 samples of six species of tuna. Genetic diversity parameters such as Number of Haplotypes (), Haplotype diversity (H), Average number of nucleoside difference (), and Nucleotide diversity (π) were calculated by DnaSP 5.10 software. C-conserved sites, PI-parsimony-informative sites, and V-variable sites were calculated using Mega 7.0 software, which performed 1000 bootstrap tests with neighbor joining. The Kimura 2-parameter model was used to construct a phylogenetic evolutionary tree. The experimental results showed that 16S rRNA was relatively conservative and could not distinguish among the six tuna species.b andⅠ could be used to identify the species. However, it is possible thatⅠ andb sequences can be used together as a DNA barcode for tuna research. A multi-gene DNA-barcode species-identification method that provides technical support for the identification of tuna and its fish products would be of great significance in promoting the accurate identification and healthy development of aquatic products.

Tuna; Molecular identification;Ⅰ;b; 16S rRNA

WANG Lianzhu, E-mail: wanglz@ysfri.ac.cn; XU Jiachao, E-mail: xujia@ouc.edu.cn

TS254.7；S917.4

A

2095-9869(2020)05-0009-09

10.19663/j.issn2095-9869.20190703002

http://www.yykxjz.cn/

陸鍵萍, 姚琳, 信紅梅, 曲夢, 江艷華, 李風(fēng)鈴, 郭瑩瑩, 王聯(lián)珠, 許加超. 線粒體Ⅰ、b和16S rRNA基因在6種金槍魚鑒定中的適用性分析. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2020, 41(5): 73–81

Lu JP, Yao L, Xin HM, Qu M, Jiang YH, Li FL, Guo YY, Wang LZ, Xu JC. Applicability analysis of mitochondrialⅠ,b and 16S rRNA genes in identification of six tuna species. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(5): 73–81

* 國家重點研發(fā)計劃(2016YFF0201805)資助[This work was supported by the National Key Research and Development Plan of China (2016YFF0201805)]. 陸鍵萍，E-mail: lujianping2014@foxmail.com

王聯(lián)珠，研究員，E-mail: wanglz@ysfri.ac.cn；許加超，教授，E-mail: xujia@ouc.edu.cn

2019-07-03,

2019-07-26

(編輯 馮小花)