曾本和，楊瑞斌，劉海平，王 建，徐兆利，何林強，曾小理，趙天一，林少卿

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院水產(chǎn)科學研究所，拉薩 850002；2.華中農(nóng)業(yè)大學，武漢 430070；3.西南大學動物科學學院，重慶 402460；4.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護重點實驗室，武漢 430223；5.西藏自治區(qū)畜牧總站，拉薩 850000)

拉薩裂腹魚(Schizothoraxwaltoni)俗稱拉薩弓魚、貝氏裂腹魚、尖嘴魚，隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)裂腹魚亞科(Schizothoracinae)裂腹魚屬(Schizothorax)，僅分布于西藏地區(qū)雅魯藏布江中上游干、支流及附屬水體，資源量少，生長速度緩慢，性成熟年齡較遲，為我國的特有種，也是西藏地區(qū)主要的經(jīng)濟魚類之一[1]。近幾十年以來，由于水電水利設(shè)施的興建[2]、外來魚類入侵[3]、過度捕撈[4]、水質(zhì)環(huán)境惡化[2]，拉薩裂腹魚被《中國脊椎動物紅色名錄》列為易危魚類(VU)[5]。因此，研究并保護拉薩腹魚資源迫在眉睫。

目前有關(guān)拉薩裂腹魚的研究資料較少，僅見于其分類學[6-7]、起源和演化[6,8]。近幾年，對拉薩裂腹魚的研究開始增多，但也只是集中在分子系統(tǒng)發(fā)育與生物地理學[9-10]、年齡與生長[11]、食性組成[12]和人工馴養(yǎng)[13-15]，有關(guān)拉薩裂腹魚人工繁殖研究幾近空白。為保護和利用拉薩裂腹魚資源，本試驗研究了拉薩裂腹魚人工繁殖方面的參數(shù)，旨在積累拉薩裂腹魚的繁殖生物學方面的基礎(chǔ)資料，為完善人工繁育技術(shù)、實施增殖放流奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 親魚來源及暫養(yǎng)

2019年4月，從雅魯藏布江拉薩至日喀則江段及拉薩河收集野生親魚4批，總計376尾，其中雌性203尾。暫養(yǎng)于西藏土著魚類增殖育種場，暫養(yǎng)池為長4 m×寬3 m×深0.5 m的室內(nèi)水泥池，進水口流速0.4 m/s，24 h增氧，流水刺激。檢查雌魚，挑選出能直接擠卵的60組，直接人工授精，雌雄比1 ∶1。能用于催產(chǎn)的親本83組，用于人工催產(chǎn)親本選擇標準為體形正常、體質(zhì)較好，雌魚腹部膨大、柔軟，倒提腹部下塌，泄殖孔凸起的；雄魚選擇大小均勻，上頜部珠星明顯，輕壓腹部有乳白色精液，遇水即散的個體。

1.2 人工催產(chǎn)

催產(chǎn)藥物組合為地歐酮(domperidone,DOM)和促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A2)，采用1針注射，每千克雌魚注射10 mg DOM+10 μg LHRH-A2，每千克雄魚注射5 mg DOM+5 μg LHRH-A2，催產(chǎn)藥物溶劑為注射用葡萄糖。注射激素后，跟蹤觀察親魚反應(yīng)情況，每24 h檢查雌魚1次，一旦發(fā)現(xiàn)能順利擠出卵子，采用100 g/m3的MS-222進行麻醉，稱量體重、體長后進行干法人工授精。

催產(chǎn)率=(產(chǎn)卵的雌魚數(shù)/催產(chǎn)的雌魚數(shù))×100%。

效應(yīng)時間為注射催產(chǎn)劑到發(fā)情產(chǎn)卵排精的時間。

1.3 精子活力觀察

雄魚在催產(chǎn)前，催產(chǎn)1、2、3、4、5 d各隨機取5尾魚，將精液(直到擠不出)置于5 mL帶刻度離心管中，記錄精液體積，存放于4 ℃冰箱，每隔2 h觀察一次精子活力，直到絕大部分精子停止運動。雄魚催產(chǎn)精子活力的觀察和測定參照文獻[16]方法并改進運用?？捎糜谌斯な诰訕藴剩赫麄€視野中70% 精子呈“旋渦”狀運動，無法看清精子的運動路線，時間不少于40 s。精子有效保存時間為在4 ℃條件下，從精液擠出直到不能用于人工授精的時間。

1.4 人工授精

采取干法進行人工授精。用于干法人工授精的精液先用離心管收集，遮光存放于冰盒中，在顯微鏡下鏡檢，使用活力好的精液。雌雄比為1 ∶1。

1.5 人工孵化

孵化容器為48 cm×35 cm×4 cm的自制孵化框，孵化框置于280 cm×50 cm×25 cm平列槽中，從一端進入曝氣后的井水，水交換量為3次/h，平列槽中水流速0.01～0.02 m/s，溶氧≥8 mg/L，水溫11.5～12.0 ℃。將受精卵平鋪在孵化框內(nèi)，孵化密度5～7 粒/cm2，每天8:00、16:00、24:00攪動魚卵1次，防止魚卵堆積，局部缺氧死亡。第3～4 d，魚卵發(fā)育到原腸中期-晚期，剔除死魚并統(tǒng)計魚卵受精率。

魚卵受精率=100%×原腸中期活卵數(shù)/魚卵總數(shù)

魚卵孵化率=100%×出膜魚苗數(shù)/受精卵總數(shù)

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)通過Excel 2010進行計算、統(tǒng)計與作圖，雄魚精液量及有效保存時間數(shù)據(jù)采用Spss 19.0統(tǒng)計軟件中one-way ANOVA進行單因子方差分析，若差異顯著，則采用Duncan′s進行多重比較，差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 自然生產(chǎn)拉薩裂腹魚雌魚產(chǎn)卵量、受精率及孵化率

2019年4月1日、4月3日、4月5日、4月9日收集的4批拉薩裂腹魚親本自然產(chǎn)卵60組，共計產(chǎn)卵77.58萬粒。親本體重(752.06～2 932.95)g，平均(1 643±395)g；體長(45.1～60.5)cm，平均(51.64±3.08)cm；每組產(chǎn)卵量(3 012～30 208)粒，總產(chǎn)卵量77.58萬粒；總計獲得受精卵66.02萬粒，受精率(54.29～99.53)%，平均(85.10±11.13)%；總計出膜魚苗56.61萬尾，孵化率(5.00～98.08)%。

2.2 人工催產(chǎn)雌性親本效應(yīng)時間、催產(chǎn)率、受精率及孵化率

親本效應(yīng)時間72～96 h，72 h占比90.67%，96 h占比9.33%。2019年4月3日催產(chǎn)拉薩裂腹魚親本68組，4月5日～4月6日累計繁殖63組，催產(chǎn)率92.65%；2019年4月7日，催產(chǎn)15組，4月9日累計繁殖12組，催產(chǎn)率80%。4月3日和4月7日繁殖兩批拉薩裂腹魚親本總計75組，平均催產(chǎn)率90.36%。兩批雌魚體重范圍(1 048.26～2 910.06)g，平均(1 574±375)g；體長范圍(48.6～66.0)cm，平均(50.79±3.63)cm；產(chǎn)卵量(5 720～42 425)粒/尾；受精率(37.43～99.77)%，平均(79.07±16.14)%；孵化率(6.36～99.44)%，平均(87.86±24.80)%。

2.3 拉薩裂腹魚雌性親本體長體重與產(chǎn)卵數(shù)量關(guān)系

拉薩裂腹魚雌性親本體長體重與產(chǎn)卵數(shù)量關(guān)系見圖1～2。隨著拉薩裂腹魚雌性親本體長體重增加，拉薩裂腹魚產(chǎn)卵量逐漸增加。

圖1 拉薩裂腹魚體重與產(chǎn)卵總數(shù)量關(guān)系

2.4 人工催產(chǎn)雄性親本精液數(shù)量及質(zhì)量

人工催產(chǎn)雄性親本精液數(shù)量及質(zhì)量見表1～2。隨著人工催產(chǎn)時間增加，拉薩裂腹魚雄魚精液量呈先升高后降低變化趨勢，且在第2 d精液量最多(8.58±5.28)mL，同1 d和3 d差異不顯著，顯著多于未催產(chǎn)和催產(chǎn)4 d、5 d雄性親本精液量。

表1 拉薩裂腹魚雄魚催產(chǎn)時間和精液量關(guān)系

在4 ℃條件下，拉薩裂腹魚精液有效保存時間在未催產(chǎn)和催產(chǎn)1 d差異不顯著；催產(chǎn)第2 d，有效保存時間顯著升高，且達到最大值(46.4±18.02)h；催產(chǎn)第3 d后，精液有效保存時間顯著降低。

圖2 拉薩裂腹魚體長與產(chǎn)卵總數(shù)量關(guān)系

表2 拉薩裂腹魚雄魚催產(chǎn)時間和精液有效保存時間的關(guān)系

3 討論

3.1 自然產(chǎn)卵和人工催產(chǎn)產(chǎn)卵量、魚卵受精率及孵化率比較

本實驗中，自然產(chǎn)卵親本單位體重及體長產(chǎn)卵量低于人工催產(chǎn)親本，受精率高于人工催產(chǎn)親本，孵化率低于人工催產(chǎn)親本。其原因可能是在野外自然成熟親本，運輸過程中部分卵粒流出，導致其單位體重產(chǎn)卵量較人工催產(chǎn)低。受精率和孵化率受魚類卵子質(zhì)量、精子質(zhì)量及操作方法的影響，在精子質(zhì)量和操作方法相同時，卵子質(zhì)量決定魚卵受精率和孵化率。在自然界，野生親本性腺能正常發(fā)育成熟；人為捕撈后，受環(huán)境的影響，親本性腺很難繼續(xù)發(fā)育，性腺發(fā)育接近V期的親本可以通過注射性激素刺激，達到性成熟；因此，理論上自然成熟親本魚卵質(zhì)量較人工催產(chǎn)親本好。但張良松對野生異齒裂腹魚[17]的研究發(fā)現(xiàn)，自然成熟親本由于部分性腺已發(fā)生退化過熟，其受精率、孵化率低于人工催產(chǎn)的親本。由于自然界親本成熟時間不明確，且不同親本成熟時間不同步，能獲得自然成熟親本數(shù)量較少，因此，在拉薩裂腹魚規(guī)?；斯し敝尺^程中一般選擇性腺接近成熟的親本進行人工催產(chǎn)。

3.2 拉薩裂腹魚催產(chǎn)效應(yīng)時間影響因素

魚類人工催產(chǎn)效應(yīng)時間受魚的種類、催產(chǎn)藥物種類、劑量及環(huán)境水溫等因素的影響。適宜種類的催產(chǎn)藥物及劑量可獲得較好的催產(chǎn)率并適當縮短催產(chǎn)效應(yīng)時間。本試驗中拉薩裂腹魚催產(chǎn)藥物種類及劑量較細鱗裂腹魚[18]、重口裂腹魚[19]、齊口裂腹魚[20]、異齒裂腹魚[17]、拉薩裸裂尻魚[21]均差別較大，催產(chǎn)效應(yīng)時間也長于以上魚類(表3)，這可能是與魚種類、催產(chǎn)藥物種類及計量、養(yǎng)殖水溫有關(guān)。水溫是影響魚類催產(chǎn)效應(yīng)時間的主要因素，一般水溫越高，效應(yīng)時間越短。魚類適宜催產(chǎn)水溫根據(jù)魚類生存水域環(huán)境水溫不同而不同，細鱗裂腹魚在水溫低于13 ℃時無法產(chǎn)卵，高于18 ℃時性腺則會出現(xiàn)嚴重退化[18]。試驗中拉薩裂腹魚長期生活在高原水域環(huán)境中，水溫較低，因此拉薩裂腹魚催產(chǎn)水溫較低，催產(chǎn)效應(yīng)時間較長。關(guān)于縮短拉薩裂腹魚人工催產(chǎn)效應(yīng)時間有待進一步研究。

表3 拉薩裂腹魚與其他裂腹魚魚類催產(chǎn)劑量、效應(yīng)時間與水溫比較