郭海燕，張耀光

(1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚(yú)類(lèi)資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市水產(chǎn)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.重慶市水產(chǎn)科學(xué)研究所，重慶 400020)

沒(méi)食子酸(gallic acid，GA)，又名五倍子酸、棓酸，化學(xué)名稱為3，4，5-三羥基苯甲酸(3,4,5-Trihydroxybenzoic acid)，是自然界存在的一種多酚類(lèi)化合物，廣泛存在于五倍子、烏桕、訶子、葡萄、茶葉等多種天然植物中[1,2]。它因其結(jié)構(gòu)本身含有三個(gè)羥基而具有較強(qiáng)的抗氧化性[3,4]，另外許多植物多酚類(lèi)物質(zhì)也被證實(shí)對(duì)多種病原菌和真菌具有抑制和殺滅作用[3-7]。在我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖上常將沒(méi)食子酸或以沒(méi)食子酸為有效成分的中草藥用作抗菌劑防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病和添加到食物、飼料中阻止因脂類(lèi)氧化等原因?qū)е碌母瘮8-13]。

藥物和化學(xué)物質(zhì)經(jīng)皮膚、腸和鰓通過(guò)血液循環(huán)被輸送到魚(yú)體的其它組織，而紅細(xì)胞是它們最先直接接觸并受影響的細(xì)胞之一[14]。由于紅細(xì)胞容易得到、易于制備、富有不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)并且攜帶豐富信息，因此經(jīng)常被用于進(jìn)行氧化損傷的研究[15，16]。南方鲇(Silurusmeridionalis)隸屬于鲇形目(Siluriformes)鲇科(Siluridae)鲇屬(Silurus)，是我國(guó)長(zhǎng)江流域特有的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。作為水產(chǎn)動(dòng)物常用的藥物，沒(méi)食子酸常被作為中草藥的有效成分對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)[11，17-19]和藥效學(xué)[7，12，13，20]方面的研究，抗氧化方面的內(nèi)容也有所涉及，如沒(méi)食子酸在淡水鮐貝[21-23]、斑馬魚(yú)[24，25]和南方鲇[26]等方面的研究。本實(shí)驗(yàn)以南方鲇紅細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象研究沒(méi)食子酸對(duì)紅細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)和表面形貌的影響作用，檢測(cè)相關(guān)氧化指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和脂類(lèi)氧化(LPO)且觀察紅細(xì)胞相應(yīng)的溶血和表面形貌的變化，以期對(duì)沒(méi)食子酸對(duì)魚(yú)類(lèi)的抗氧化作用做進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)來(lái)源和馴養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)為本實(shí)驗(yàn)室自養(yǎng)健康二齡南方鲇，體重(1 492.90±84.8)g，全長(zhǎng)(55.94±0.84)cm。養(yǎng)殖在實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)，養(yǎng)殖缸規(guī)格(80 cm×45 cm×50 cm)，每組系統(tǒng)上下各8個(gè)魚(yú)缸，每缸1尾魚(yú)，水流入速度25 mL/s，養(yǎng)殖用水是經(jīng)脫氯、曝氣、充氧的24 h循環(huán)自來(lái)水，水溫控制在(26±2)℃，pH=(6.5±0.2)，溶氧大于6 mg/L，光周期設(shè)定為12 L ∶12 D。實(shí)驗(yàn)期間每天投喂泥鰍，投喂后及時(shí)撈走養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)的糞便和殘餌，日換水量約為馴化水體的10%。

1.2 紅細(xì)胞懸液的制備

實(shí)驗(yàn)用紅細(xì)胞取自本實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)自養(yǎng)健康南方鲇。每次正式實(shí)驗(yàn)前取新鮮血液，用一次性注射器尾靜脈抽血至預(yù)先經(jīng)肝素鈉抗凝的EP管中。血液靜置片刻后于4 ℃，2 500 r/min離心10 min，棄上清液。繼續(xù)用0.65%滅菌生理鹽水清洗2～3次至上清液呈無(wú)色透明。使用時(shí)用生理鹽水制成1%的紅細(xì)胞懸液，即配即用。

1.3 化學(xué)試劑和儀器

沒(méi)食子酸對(duì)照品(GA，純度為90.1%)。肝素鈉購(gòu)自西南大學(xué)附屬醫(yī)院?？偟鞍?、SOD、CAT、GPx和丙二醛(MDA)等試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所。氯化鈉、戊二醛、乙醇、叔丁醇、乙酸乙酯、冰醋酸等試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。儀器包括多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific Inc，Thermo)、紫外分光光度計(jì)(UV-2450，SHIMADZU)、掃描電鏡(JSM-6510LV，SHIMADZU)、離子濺射裝置(INCA X-Max 250)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法和濃度設(shè)定參考文獻(xiàn)[22，27]，且在其基礎(chǔ)上有所修改。

1.4.1 沒(méi)食子酸對(duì)健康南方鲇紅細(xì)胞溶血的測(cè)定

制備1%紅細(xì)胞懸液，加藥組各管加入不同濃度沒(méi)食子酸溶液，終濃度分別為5、10、20、40和80 mg/L，以不加藥物加入等量的生理鹽水為對(duì)照管，(27±0.5)℃分別孵育4 h和24 h，每個(gè)濃度重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，避免外力促進(jìn)紅細(xì)胞溶血。到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液于540 nm處測(cè)吸光度。

1.4.2 沒(méi)食子酸對(duì)健康南方鲇抗氧化酶和脂類(lèi)氧化損傷的測(cè)定

制備1%紅細(xì)胞懸液，加藥組各管加入不同濃度沒(méi)食子酸溶液，終濃度分別為5、10、20、40和80 mg/L，以不加藥物加入等量的生理鹽水為對(duì)照管，(27±0.5)℃分別孵育4 h和24 h，每個(gè)濃度重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，不要用力搖動(dòng)EP管，避免外力促進(jìn)紅細(xì)胞的溶血。到達(dá)預(yù)定時(shí)間時(shí)，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清留紅細(xì)胞沉淀，按照總蛋白、SOD、CAT和GPx及MDA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行樣本前處理及測(cè)定操作?？偟鞍子肂CA法，脂類(lèi)氧化損傷用硫代巴比妥酸反應(yīng)法。

1.4.3 沒(méi)食子酸對(duì)健康南方鲇紅細(xì)胞表面形貌的影響

取上述紅細(xì)胞樣品1 000 r/min，離心10 min，用生理鹽水洗滌2～3次；2.5%戊二醛固定過(guò)夜，開(kāi)始固定時(shí)應(yīng)輕輕攪動(dòng)，使樣品均勻分布在固定液中，固定結(jié)束，離心后棄上清，用生理鹽水清洗2～3次；30%、50%、70%、85%和95%濃度乙醇梯度脫水，逐級(jí)脫水各1次，每次浸泡10 mim，離心5 min，再用100%乙醇脫水兩次；用叔丁醇轉(zhuǎn)換2次，每次30 min，-20 ℃冰箱保存；-80 ℃冷凍干燥；將干燥完的樣品放入離子濺射裝置噴金150 s，掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察拍照。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按試劑盒說(shuō)明書(shū)給定的公式進(jìn)行計(jì)算，常規(guī)計(jì)算用EXCEL，后用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。全文數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，統(tǒng)計(jì)上顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇紅細(xì)胞溶血的影響

(27±0.5)℃時(shí)健康南方鲇正常紅細(xì)胞分別在0、5、10、20、40和80 mg/L沒(méi)食子酸溶液中孵育4 h和24 h溶血情況如圖1。4 h組各濃度之間紅細(xì)胞溶血均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異，24 h組隨著沒(méi)食子酸濃度增大紅細(xì)胞溶血OD先降低后升高，與對(duì)照組相比，5 和10 mg/L濃度組溶血顯著降低，40 和80 mg/L 濃度組溶血顯著升高。

圖1 沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇紅細(xì)胞溶血情況的影響

2.2 沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇紅細(xì)胞抗氧化酶的影響

(27±0.5)℃時(shí)健康南方鲇正常紅細(xì)胞分別在0、5、10、20、40和80 mg/L沒(méi)食子酸溶液中孵育 4 h和24 h抗氧化酶(SOD、CAT和GPx)的變化趨勢(shì)如圖2所示。SOD活力在4 h先升高再降低的趨勢(shì)，24 h時(shí)5 mg/L濃度組比對(duì)照組略有下降，接著上升然后再下降，兩組均在20 mg/L時(shí)達(dá)到最大值。CAT 活力在4 h時(shí)5、10 和20 mg/L濃度組與對(duì)照組差異不顯著，40與80 mg/L比20 mg/L顯著下降，但與對(duì)照組差異不顯著；24 h時(shí)隨著沒(méi)食子酸濃度的增大，CAT活力呈先升高再降低的趨勢(shì)變得比較明顯，最大值在20 mg/L時(shí)出現(xiàn)。GPx活力在4 h時(shí)5、10和20 mg/L濃度組比對(duì)照組有所增大，但是各濃度組之間差異不顯著，40和80 mg/L比對(duì)照組顯著降低；24 h時(shí)5、10和20 mg/L濃度組比對(duì)照組顯著升高，且10和20 mg/L之間差異不顯著，接著活力下降。并且三種酶同一濃度的酶活性24 h時(shí)比4 h時(shí)均有不同程度地降低。

圖2 沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇紅細(xì)胞SOD、CAT及GPx活性的影響

2.3 沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇紅細(xì)胞脂類(lèi)過(guò)氧化的影響

MDA是硫代巴比妥酸反應(yīng)的產(chǎn)物，它的含量可以反映機(jī)體脂類(lèi)氧化的程度。經(jīng)測(cè)定，(27±0.5)℃時(shí)健康南方鲇正常紅細(xì)胞分別在0、5、10、20、40和80 mg/L GA溶液中孵育 4 h和24 h MDA的水平隨著沒(méi)食子酸濃度的增大先降低后增大，4 h時(shí)20 mg/L MDA含量為最小，24 h時(shí)20 mg/L MDA含量達(dá)到最小，40和80 mg/L顯著高于對(duì)照組，而且同一濃度24 h的MDA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于4 h時(shí)的含量(圖3)。

圖3 沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇紅細(xì)胞MDA含量的影響

2.4 沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇紅細(xì)胞表面形貌的影響

分別在0、5、10、20、40和80 mg/L GA溶液中孵育 4 h和24 h，掃描電鏡下正常紅細(xì)胞呈卵圓形或橢圓形，表面光滑，均勻飽滿無(wú)可見(jiàn)的表面損傷。4 h除80 mg/L濃度組可以看到少數(shù)紅細(xì)胞表面略有皺縮變形，其它組與對(duì)照組無(wú)差異。24 h時(shí) 5、10、20 mg/L濃度組與對(duì)照組相比紅細(xì)胞均無(wú)變化，40和80 mg/L濃度組紅細(xì)胞表面損傷逐漸明顯，尤其是80 mg/L濃度組視野范圍內(nèi)的紅細(xì)胞顯著減少，(27±0.5)℃時(shí)健康南方鲇正常紅細(xì)胞40和80 mg/L濃度組紅細(xì)胞的SEM表面形貌如圖4。

圖4 沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇紅細(xì)胞表面形貌的影響

3 討論

紅細(xì)胞是機(jī)體血液循環(huán)系統(tǒng)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、運(yùn)輸、調(diào)節(jié)、防御等功能的重要體現(xiàn)者，且紅細(xì)胞對(duì)氧化損傷作用極為敏感[28]。過(guò)氧化損傷的產(chǎn)生主要是由于內(nèi)源性或外源性的某些物質(zhì)，在一定條件下產(chǎn)生一系列過(guò)氧化反應(yīng)生成自由基產(chǎn)物，如活性氧等，引起紅細(xì)胞膜磷脂不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，使膜磷脂組成發(fā)生改變，即不飽和脂肪酸比例降低，飽和脂肪酸比例增加，脂質(zhì)過(guò)氧化還可以引起膜硬度的增加，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，最終導(dǎo)致溶血[28]。為了對(duì)抗這些活性氧，機(jī)體為紅細(xì)胞配備了有效的酶和非酶抗氧化劑。SOD、CAT和GPx就是其中三種重要的抗氧化酶[29]。MDA的測(cè)定通常與抗氧化酶的測(cè)定相互配合來(lái)詮釋機(jī)體或細(xì)胞氧化水平。紅細(xì)胞表面形貌的變化通常在醫(yī)學(xué)、化學(xué)和新材料學(xué)上應(yīng)用較多[28]，水產(chǎn)上較少應(yīng)用。

3.1 沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇紅細(xì)胞溶血和細(xì)胞存活率的影響

紅細(xì)胞溶血常用來(lái)計(jì)算紅細(xì)胞的存活率。4 h各濃度組紅細(xì)胞的溶血與對(duì)照組比較均沒(méi)有顯著差異，這說(shuō)明各濃度組之間紅細(xì)胞的存活率是一致的，沒(méi)食子酸對(duì)紅細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性，但此時(shí)抗氧化酶和脂類(lèi)氧化的指標(biāo)已經(jīng)有一定的變化。24 h隨著濃度增大紅細(xì)胞的存活率先升高后降低。從紅細(xì)胞溶血的角度觀察，在較低濃度時(shí)(5和10 mg/L)時(shí)沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇紅細(xì)胞有抗氧化作用而顯示出一定的保護(hù)作用，而在較高濃度時(shí)(40和80 mg/L)顯示出明顯的細(xì)胞毒性而導(dǎo)致紅細(xì)胞大量溶血。從圖1中看到，同一濃度的吸光度無(wú)論是未給藥組還是給藥組，24 h組均相應(yīng)地大于4 h組，說(shuō)明時(shí)間是紅細(xì)胞溶血和細(xì)胞存活率的重要因素。Yen等[30]研究發(fā)現(xiàn)37 ℃時(shí)人類(lèi)正常淋巴細(xì)胞在0～0.24 mmol/L GA溶液中孵育30 min時(shí)未發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸對(duì)其有明顯的細(xì)胞毒作用。Labieniec等[21]提出當(dāng)?shù)愵?lèi)消化腺細(xì)胞在多酚類(lèi)物質(zhì)中孵育呈現(xiàn)出時(shí)間和濃度依賴性地減少，表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性的特征但并未顯示出明顯的細(xì)胞毒性。這些研究都說(shuō)明沒(méi)食子酸對(duì)細(xì)胞的存活率的影響與濃度、時(shí)間有一定關(guān)系。

3.2 沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇紅細(xì)胞抗氧化酶的影響

Gil-Longo等[27]報(bào)道沒(méi)食子酸自氧化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生超氧負(fù)離子、過(guò)氧化氫和奎寧等活性氧，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明了抗氧化酶的活性與活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成過(guò)程與沒(méi)食子酸的濃度相關(guān)的。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇紅細(xì)胞的SOD、CAT和GPx活性有時(shí)間和濃度依賴性的影響。這與Techer等[24]研究GA對(duì)斑馬魚(yú)(組織勻漿物)的抗氧化酶活性的影響是非常一致的，均以20 mg/L或40 mg/L濃度時(shí)酶活性達(dá)到最大值，隨后降低，酶活性顯著被抑制的最低濃度是45 mg/L。本研究中三種酶在20 mg/L或以下的濃度時(shí)酶活性與對(duì)照組相比均有不同程度地顯著升高，而在20 mg/L濃度或以上的濃度時(shí)酶活性有所降低，這說(shuō)明GA對(duì)南方鲇紅細(xì)胞的氧化作用有兩面性，結(jié)果顯示20 mg/L以下有抗氧化作用，而20 mg/L以上有促氧化作用。

3.3 沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇紅細(xì)胞脂類(lèi)過(guò)氧化的影響

Li等[4]研究發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸喂飼雄性快速老化小鼠30 d時(shí)，腦和肝里MDA水平比正常鼠有所降低。Yen等[30]研究Fe3+-H2O2介導(dǎo)的人淋巴細(xì)胞的氧化損傷時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著沒(méi)食子酸濃度的增大(0.004～0.82 mmol/L)硫代巴比妥酸的生成增大，并且最大值的出現(xiàn)大于1.65 mmol/L，隨后TBARS的生成開(kāi)始變小，說(shuō)明沒(méi)食子酸對(duì)氧化損傷的保護(hù)作用有一定的濃度依賴。Gupta等[31]指出高濃度的多酚類(lèi)物質(zhì)自身能產(chǎn)生一定的毒性。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與這些理論吻合，較低濃度時(shí)(20 mg/L及以下濃度)沒(méi)食子酸可以降低南方鲇紅細(xì)胞脂類(lèi)的氧化，而40 mg/L及以上濃度能促使脂類(lèi)的進(jìn)一步氧化。因此說(shuō)較低濃度時(shí)沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇的紅細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

3.4 沒(méi)食子酸對(duì)南方鲇紅細(xì)胞表面形貌的影響

紅細(xì)胞膜由整齊有序的磷脂雙分子層骨架和膜表面附著的外周蛋白共同組成，外界因素影響使其整齊有序性受到破壞，從而影響其正常功能[28,32]，進(jìn)一步會(huì)導(dǎo)致表面形貌的變化。紅細(xì)胞在氧化過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)多的活性氧對(duì)其脂質(zhì)和蛋白質(zhì)造成了損傷，Labieniec等[22]就多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)淡水鮐貝消化腺細(xì)胞膜脂質(zhì)的流動(dòng)性的研究中建議此類(lèi)物質(zhì)的膜脂質(zhì)的流動(dòng)性依賴于它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)(多羥基的數(shù)量和極性)，推測(cè)它們結(jié)合蛋白質(zhì)的能力是導(dǎo)致膜質(zhì)流動(dòng)性和表面形貌變化的主要原因，但是質(zhì)膜的水合部分流動(dòng)性的原理還有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，低濃度時(shí)沒(méi)食子酸會(huì)對(duì)紅細(xì)胞的氧化有一定的保護(hù)作用，它們可以修飾某些蛋白，使它們結(jié)構(gòu)松散，而高濃度時(shí)它們大部分覆蓋在蛋白表面，使它們的結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定而導(dǎo)致膜質(zhì)流動(dòng)[33]，達(dá)到一定濃度時(shí)即體現(xiàn)在紅細(xì)胞的表面形貌上。另?yè)?jù)報(bào)道多酚類(lèi)物質(zhì)能與多種金屬螯合[15]，如Fe3+、Cu2+和Ca2+等，而Ca2+在細(xì)胞膜的穩(wěn)定方面起重要作用，這可能也是沒(méi)食子酸影響紅細(xì)胞表面形貌變化的原因之一。而紅細(xì)胞表面形貌的變化也正說(shuō)明了細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的一致性。