李艷秋，劉曉丹，范秋靈，田淑艷，劉雪，王力寧，姚麗

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腎臟內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001）

慢性腎臟病的發(fā)生率在逐年增加，對其發(fā)病機制的研究日益重要[1-2]。目前腎臟病的研究多集中在外周血、尿液、腎皮質(zhì)等，而腎臟病的真正發(fā)生部位腎小球卻鮮有報道。隨著科學(xué)的進步，提取腎小球的方法逐漸出現(xiàn)。如激光捕獲顯微切割技術(shù)[3-4]、微分篩選[5]、磁珠灌注腎臟技術(shù)等[6-7]，其中磁珠獲得大量腎小球的方法受到大家的普遍歡迎。但是磁珠價格不菲，有些實驗動物本身價格就比較昂貴，一些要求獲取較多腎小球的實驗預(yù)算就會增多，導(dǎo)致其中部分有創(chuàng)意和有意義的實驗設(shè)計難以實現(xiàn)，使其使用受到一定的限制。本實驗對該技術(shù)略微進行改變，使磁珠的使用量大大減少，同時仍可獲得大量的腎小球，希望該簡單經(jīng)濟實用的實驗方法為廣大的科研工作者提供方便。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級雌性12 周齡C57BL/6小鼠，購自中國北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：2016102。飼養(yǎng)在中國醫(yī)科大學(xué)動物部SPF 級動物房，溫度（23±3）℃，濕度（50±20）%，予以12 h 交替照明，根據(jù)國家標準（GB 14925-2001）的規(guī)定，所有小鼠均可自由進食、飲水。NZB/WF1 雌性小鼠（購自美國Jackson 實驗室），從8 周開始飼養(yǎng)至28 周。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)動物保護與利用委員會批準。動物飼養(yǎng)至28 周齡。

1.2 實驗方法

1.2.1 經(jīng)胸主動脈行腎臟磁珠灌流術(shù)1%戊巴比妥鈉（30 ～40 mg/kg）經(jīng)腹腔注射麻醉。開腹以暴露腹部器官，結(jié)扎遠端腹主動脈及下腔靜脈，結(jié)扎腸系膜上動脈和腹腔動脈。開胸后，于胸主動脈上1/3 處插入靜脈留置針（24 GA，0.75IN，BD），用手術(shù)縫線固定留置針。于下腔靜脈靠近結(jié)扎處近心端用剪刀剪開0.3 cm 開口。將4℃磷酸鹽緩沖液（PBS）經(jīng)留置針灌注腎臟，確定流出口無血液流出。經(jīng)上述過程后，先將4×108磁珠/ml（美國Dynal 公司）按照說明書進行清洗，然后將4℃磁珠工作液（不同濃度磁珠）經(jīng)靜脈留置針灌注腎臟。

1.2.2 摘取腎臟和磁珠收集腎小球取下雙側(cè)腎臟，去掉被膜，剪去腎盂腎盞，剩余腎臟于冰上剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm 小塊。加入相應(yīng)體積膠原酶A 工作液，震蕩，置于恒溫箱（37℃）30 min，每5 min 振蕩混合，進行充分消化。于篩網(wǎng)上輕壓（3、4 次）再次消化，使腎組織通過100 μm 篩網(wǎng)，邊壓邊用5 ml 4℃ PBS 沖洗網(wǎng)面至燒杯中，重新取1 個篩網(wǎng)再重復(fù)1 次。腎小球懸液離心（250 r/min，4℃、10 min），小心吸去上清液，將腎小球沉淀移至1.5ml 離心管，加入1 ml 4℃ PBS，置于磁力架上。

1.2.3 去除磁珠加入110μl 蛋白裂解液，將含有磁珠的腎小球于冰上裂解30min，離心（2000r/min，4℃、10min），可吸出108μl 含蛋白上清液并移至1.5ml 離心管中，進行腎小球蛋白的純化、定量。

1.2.4 腎小球蛋白的純化和濃度的定量2-D Quant kit 試劑盒定量，方法按試劑盒操作說明。采用紫外分光光度計，于480nm 波長處測定樣本和標準品的吸光度值。以得到的吸光度值繪制標準曲線，將樣本與標準曲線進行比較，得到樣本蛋白質(zhì)的濃度。

1.2.5 腎小球分離效果的觀察①經(jīng)磁珠分離腎小球純度：將從C57BL/6 和NZB/WF1 小鼠腎臟獲得的腎小球用1ml PBS 稀釋，取10 μl 于玻片上觀察，分別由2 個實驗者計數(shù)4 次，取平均值。②用磁珠灌注C57BL/6 和NZB/WF1 小鼠腎臟，立即留取腎臟皮質(zhì)，F(xiàn)AA 固定液固定，行HE 染色，萬能顯微鏡下觀察腎小球中磁珠的分布情況。③用磁珠灌注C57BL/6 和NZB/WF1 小鼠腎臟，收集分離出的含有磁珠的腎小球于2.5%戊二醛中固定，掃描電鏡下觀察分離出的腎小球超微結(jié)構(gòu)。

1.2.6 檢測不同濃度磁珠提取的腎小球蛋白濃度分別配置4×105和4×106磁珠/ml 和參考TAKEMOTO[6]配置8×107磁珠/ml 磁珠濃度。先參考文獻[6]用40 ml 3種磁珠濃度提取，檢測提取的腎小球蛋白濃度。再用10、20 和30 ml 篩選出的合適磁珠濃度提取，檢測提取的腎小球蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎小球分離效果

2.1.1 萬能顯微鏡下的觀察結(jié)果可見含有磁珠的腎小球分布于滿視野，偶可見少量的腎小管組織（見圖1）。28 周齡C57BL/6 小鼠腎小球的分離純度為（95.7±2.3）%，而同齡的NZB/WF1 小鼠的分離純度略為降低，是（86.35±3.57）%。

2.1.2 HE 染色顯示的腎小球的分離結(jié)果光學(xué)顯微鏡下可見幾乎所有的C57BL/6 小鼠腎小球含有5 ～6個以上的磁珠，其主要分布在入球和出球動脈，腎小球周圍組織偶可見。見圖2。

2.1.3 掃描電鏡顯示的腎小球的分離結(jié)果磁珠灌注C57BL/6 小鼠后分離出的含有磁珠的腎小球在掃描電鏡下觀察，可見結(jié)構(gòu)較完整，無破壞的痕跡。見圖3。

2.2 不同濃度磁珠濃度提取小鼠腎小球蛋白濃度比較

4×106磁珠/ml 和8×107磁珠/ml 提取的腎小球蛋白含量接近（見表1），磁珠用量為40ml。再用4×106磁珠/ml，10、20 及30ml 磁珠對小鼠進行實驗。濃度為4×106磁珠/ml 的10ml 磁珠提取小鼠的腎小球最少，而20 和30ml 提取的腎小球無差異（見表2）。所以用20ml 濃度為4×106磁珠/ml 獲取的蛋白含量最恰當(dāng)。而病理鼠NZB/WF1 由于血管條件的差異，獲取的蛋白會稍有差異，但與C57BL/6 小鼠的蛋白含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 用磁珠分離C57BL/6 小鼠的腎小球

圖2 磁珠灌流C57BL/6 小鼠腎臟后（HE 染色）

圖3 含有磁珠的腎小球的掃描電鏡（×2 000）

表1 不同磁珠濃度提取腎小球蛋白含量比較 （μg，±s）

表1 不同磁珠濃度提取腎小球蛋白含量比較 （μg，±s）

注：?與4×105（磁珠/ml）濃度比較，P ＜0.05。

磁珠濃度 C57BL/6 小鼠 NZB/WF1 小鼠4×105 磁珠/ml 23.70±4.50 18.16±3.23 4×106 磁珠/ml 56.15±9.77? 50.86±2.60?8×107 磁珠/ml 54.08±6.96? 51.38±6.21?F 值 71.471 113.173 P 值 0.000 0.000

表2 濃度為4×106 磁珠/ml 的不同體積磁珠提取 腎小球蛋白含量比較 （μg，±s）

表2 濃度為4×106 磁珠/ml 的不同體積磁珠提取 腎小球蛋白含量比較 （μg，±s）

注：?與10 ml 體積/小鼠比較，P ＜0.05。

體積 C57BL/6 小鼠 NZB/WF1 小鼠10 ml 19.51±1.68 16.80±1.16 20 ml 54.84±5.59? 51.31±4.37?30 ml 55.45±3.99? 50.87±3.10?F 值 139.487 189.925 P 值 0.000 0.000

3 討論

近年來，隨著人類基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等領(lǐng)域的深入研究，科學(xué)家意識到，蛋白質(zhì)是最終實現(xiàn)編碼基因和非編碼基因功能的分子，即蛋白才是生物功能的直接實現(xiàn)者[8-9]。而蛋白質(zhì)譜技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)信息的發(fā)展又促使科學(xué)家對蛋白本身的研究進一步加深[10]。目前有關(guān)腎臟病的蛋白組學(xué)研究的對象多是血液[11]、血漿[12]、尿液[13]、腎臟皮質(zhì)[14]。篩選技術(shù)分離大鼠和兔腎小球的效果較好，而小鼠腎小球的直徑與它們的腎小管相似，篩選技術(shù)提取的腎小球的純度及蛋白的含量都不是非常理想。同時臨床上又很難大量獲得患者的腎小球以滿足突飛猛進的醫(yī)學(xué)研究需要，如何快速、大量、高純度地獲得小鼠腎小球是科研人員面臨的首要挑戰(zhàn)。

本實驗主要對傳統(tǒng)的心臟灌注方法進行改良。首先，傳統(tǒng)的心臟灌流是將磁珠液直接注入心臟，而本實驗直接從胸主動脈灌注磁珠液，磁珠不經(jīng)過心臟，減少其在心臟的無效滯留。其次，結(jié)扎腹主動脈遠端、腸系膜上動脈和腹腔動脈（該血管為腸和肝臟提供血液），能減少磁珠對其他重要臟器的灌注，以保證更多更有效的磁珠進入腎臟組織。所以本實驗技術(shù)提高磁珠的有效利用率，減少磁珠的總用量，大大降低實驗成本。筆者嘗試通過腹主動脈，但由于動脈的孔徑和彈性不同，并且受實驗動物的應(yīng)變、年齡或狀態(tài)的影響，因此提取的腎小球數(shù)量沒有胸主動脈穩(wěn)定。

本實驗分離的腎小球結(jié)構(gòu)完整，純度高，減少了磁珠的用量，降低了實驗的成本，與TAKEMOTO等[6]比較，體現(xiàn)本實驗技術(shù)的優(yōu)點。

在一些疾病模型中，胸主動脈灌注具有較大的優(yōu)勢。與傳統(tǒng)灌注相比，因為該疾病小鼠本身血管的病變較重，有時甚至呈現(xiàn)嚴重血管炎的表現(xiàn)，其腹主動脈的狀態(tài)隨年齡的增長狀態(tài)更差，當(dāng)插入導(dǎo)管時血管容易受損。如果導(dǎo)管插入胸主動脈，血管壁更厚，更容易處理。與同齡的C57BL/6 正常小鼠比較，NZB/WF1 腎小球提取的數(shù)量和蛋白含量略有減少，但是無差異。所以實驗者可以根據(jù)其實驗對象選擇不同的實驗方式。

本實驗方法的優(yōu)勢：①獲得的分離腎小球和蛋白的純度很高，并與其他研究結(jié)果基本一致。在不同品系和年齡的小鼠中，嘗試通過胸主動脈灌注腎臟，可以提高成功率，以免因腹主動脈的發(fā)育不成熟或者疾病影響實驗的效果。②本實驗室同樣提取總RNA，RNA濃度為772.10 ～1 084.97 ng/μl，OD260/OD280 均大于2.07，完全可以適合目前任何熱點的腎小球編碼和非編碼RNA 的研究（內(nèi)容將在其他文章發(fā)表）。

總之，本實驗提出一種分離高純度小鼠腎小球的有效方法。這種方法在不影響蛋白純度的情況下降低操作過程中的難度，更重要的是減少磁珠的用量，大大節(jié)約成本。對那些想要研究腎小球病變，包括足細胞、系膜細胞、內(nèi)皮細胞的研究者都值得進行嘗試。