房子倩，龔永媚，徐昊，黃健華，黃克強

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 正畸科，遼寧 錦州 121004；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 外科學(xué)重點實驗室，遼寧 錦州 121000）

舌癌是口腔癌中常見的惡性腫瘤之一，在我國，舌癌發(fā)病率居口腔癌第1 位[1]。舌癌生長快、浸潤性強、惡性程度較高，常波及舌肌致舌運動受限以及語言障礙、吞咽困難，并易通過血液、淋巴循環(huán)通路至全身轉(zhuǎn)移，預(yù)后差[2]。目前手術(shù)為主的綜合治療是其主要治療方式，由于位置較為特殊，手術(shù)切除范圍受限，且易破壞患者容貌，給患者身心帶來極大傷害。近年來舌癌發(fā)病率呈上升趨勢且不斷年輕化[3]，因此，研究新型有效藥物對于舌癌的治療有重要意義。

熊果酸是一種存在于天然植物中的三萜類化合物，廣泛存在于蔬菜和中藥中。已證明熊果酸具有抗炎、降溫、保護肝損傷等作用[4-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸有抗癌及抗血管生成等作用[6-8]。目前國內(nèi)外關(guān)于熊果酸對舌癌影響及機制的詳細研究相對較少，本實驗以人舌癌細胞Tca8113 為研究對象，探究熊果酸對其生長、遷移和凋亡的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熊果酸（藥物濃度≥98%，南京景竹生物公司）， 分子式：C30H48O3，分子量為456.68，CAS 號：77-52-1。 人舌鱗癌細胞株Tca8113（美國ATCC 公司），胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），MTT（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（武漢碧云天生物公司），兔抗人局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase, Fak）、磷酸化局部黏著斑激酶（phosphorylated focal adhesion kinase, p-Fak）、B細胞淋巴瘤-2（B cell Lymphoma 2, Bcl-2）、Bcl-2- Associated X 的 蛋 白 質(zhì)（Bcl-2-associated X protein,Bax）、活化冬氨酸蛋白水解酶-3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Cleaved-caspase 3）抗體、 辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（沈陽萬類生物公司），流式細胞儀、電泳儀（美國BD 公司），自動 凝膠成像儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher 公司），倒置顯微鏡（德國LEICA 公司）。

1.2 方法

將含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基（含青霉素100 u/ml、鏈霉素100 mg/L）置于37℃、5%二氧化碳恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)人舌癌Tca8113 細胞。待細胞處于對數(shù)生長期時，用0.25% EDTA 胰蛋白酶消化和傳代，進行以下實驗。

1.2.1 MTT 法測試熊果酸對Tca8113 細胞活性的影響取對數(shù)生長期Tca8113 細胞消化后離心收集，重懸后稀釋濃度為5×104個/ml 接種于96 孔板中，每孔加200 恒溫箱培養(yǎng)24 h 后，加入不同濃度梯度（0、20、40、50、80 及100 μmol/L）熊果酸的培養(yǎng)基于預(yù)設(shè)6 組復(fù)孔中，24 h 后每孔中加20 μl MTT 染色液孵育4 h，吸出上清液后加150 μl DMSO，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀（波長490 nm）測各孔光密度（OD）值，計算各濃度細胞生長抑制率。計算方法：細胞生長抑制率（%）=（1-實驗組A 值/對照組A 值）× 100%。

1.2.2 克隆形成實驗取對數(shù)生長期Tca8113 細胞消化后離心收集，重懸接種于6 孔板內(nèi)，500 個/孔。待細胞貼壁后加入80 μmol//L 含熊果酸培養(yǎng)液并設(shè)置陰性對照組。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d 后吸棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌2 次后加結(jié)晶紫染色10 min，PBS 再次清洗，拍照記錄實驗結(jié)果。

1.2.3 劃痕實驗檢測熊果酸對舌癌細胞Tca8113 遷移的影響將密度為4×105個/ml 的Tca8113 細胞每孔2 ml 接種于6 孔板中，置恒溫箱培養(yǎng)24 h，細胞生長融合達90%左右時用200 μl 移液器槍頭均勻劃痕，用PBS 洗滌去除漂浮細胞，加入含熊果酸（8 μmol/L） 培養(yǎng)液并設(shè)空白對照組。分別于0、12 及24 h 后觀察對照組與實驗組劃痕遷移情況，用Image J 圖像處理軟件分別測量0、12 及24 h 的劃痕間距并計算其遷移率。

1.2.4 Hoechst33342 染色觀察舌癌細胞Tca8113 的凋亡Tca8113 細胞處于對數(shù)生長期時，消化收集后制成細胞懸液接種于12 孔板內(nèi)，每孔1×105個細胞，待細胞融合90%左右，加藥分別培養(yǎng)0、12 及24 h 后，加入5 μg/ml Hoechst33342 工作液于37℃恒溫孵箱染色15 min，用熒光照相顯微鏡拍照記錄。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測Tca8113 細胞的凋亡取對數(shù)生長期Tca8113 細胞消化后離心收集，按5×105個細胞接種于4 個培養(yǎng)皿中，設(shè)置空白對照組及實驗組（熊果酸80 μmol/L），孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后觀察。加藥培養(yǎng)后分別于12 和24 h 消化離心，PBS 清洗2 次后加入150 μl PBS 重懸細胞。向細胞懸液內(nèi)加入5 μl AV（annexin V-FITC），4℃避光下孵育15 min 后加入10 μl 碘化丙錠（PI），混勻后孵育5 min，上機進行流式細胞儀檢測。

1.2.6 Western blotting 檢測相關(guān)蛋白表達取處于對數(shù)生長期Tca8113 細胞消化重懸后制成密度為5× 105個/ml 的單細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，待融合至80%時進行加藥實驗。設(shè)置空白對照組及實驗組；收集Tca8113 細胞并于0、1、3、6、12 及24 h 后分別取出相應(yīng)培養(yǎng)皿，待細胞在冰上裂解后提取細胞蛋白并檢測蛋白濃度后制樣。上樣后進行電泳，用聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜，封閉1.5 h 后，分別加一抗p-Fak、Fak、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3，4℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，經(jīng)室溫孵育2 h 后洗滌，加高敏熒光顯影液曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 軟件，計量資料以均數(shù)± 標(biāo)準差（±s）表示，比較采用t檢驗或單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熊果酸對Tca8113 細胞活性的影響

MTT 實驗結(jié)果顯示，使用不同濃度（0、20、40、 50、80 及100 μmol/L）熊果酸處理Tca8113 細胞，細胞 增殖抑制率分別為（0.00±0.00）%、（7.41±0.56）%、（22.19±1.64）%、（41.58±1.10）%、（51.11±2.00）%和（71.08±2.71）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.595，P=0.000），隨藥物濃度增加，細胞增殖抑制率上升（見圖1）。熊果酸濃度設(shè)為0 μmol/L 組、40 μmol/L 組和80 μmol/L 組，其克隆形成率分別為（73.0±3.6）%、（13.6±2.8）%和（0.0±0.0）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng) 計學(xué)意義（F=36.442，P=0.000）；與0 μmol/L 組比較，40 μmol/L 組和80 μmol/L 組克隆形成率降低（P＜ 0.05），80 μmol/L 組未見明顯克隆株，處于靜止期（見圖2）。

圖1 不同濃度熊果酸處理24 h 對Tca8113 細胞活性的影響（±s）

圖2 不同濃度熊果酸對細胞克隆形成的影響（±s）

2.2 熊果酸對人舌癌Tca8113 細胞凋亡的影響

0 h 組細胞細胞核彌散均勻藍光，顏色較為淺淡，形態(tài)規(guī)則，無固縮、碎裂；12 h 組出現(xiàn)多數(shù)細胞核高亮度熒光染色，不同程度固縮、碎裂；24 h 組大部分細胞細胞核呈高亮熒光染色，核固縮、碎裂的細胞更多（見圖3）。

給 藥0、12 和24 h 后凋 亡率分別 為（0.73± 0.12）%、（21.91±1.30）% 和（44.36±2.04）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=736.006，P= 0.000）；與0 h 組比較，12 h 和24 h 組凋亡率升高（P＜ 0.05），且隨時間的增加凋亡率隨之升高（見圖4）。

2.3 熊果酸對舌癌細胞Tca8113 遷移的影響

12 和24 h 后空白對照組發(fā)生遷移（見圖5、6 和表1），實驗組的劃痕比空白對照組寬，遷移率隨時間的延長而提高，鏡下觀察可見細胞的體積減小、形態(tài)皺縮等變化，劃痕后細胞愈合能力降低并隨時間的延長而降低。12 h 實驗組與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.911，P=0.041）；24 h 實驗組與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.539，P=0.001）；24 h 實驗組與12 h 實驗組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= -13.735，P=0.000）。

2.4 Tca8113 細胞的相關(guān)蛋白表達

各相關(guān)蛋白相對表達水平在不同時間點的比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），p-Fak、Fak、Bcl-2 的蛋白 表達水平隨時間延長而降低，而Bax、Cleaved Caspase-3的蛋白表達水平隨時間延長而升高。見圖7 和表2。

圖3 各組細胞的形態(tài)學(xué)改變（Hoechst33342 染色）

圖4 熊果酸對Tca8113 細胞凋亡的影響

圖5 兩組不同時間點的劃痕比較

圖6 熊果酸對Tca8113 細胞遷移能力的影響（±s）

表1 熊果酸對Tca8113 細胞遷移率的影響 （n =3，%，±s）

表1 熊果酸對Tca8113 細胞遷移率的影響 （n =3，%，±s）

注：①與空白對照組比較，P ＜0.05；②與12 h 實驗組比較，P ＜ 0.05。

組別 12 h 24 h空白對照組 14.29±3.50 64.23±6.70實驗組 7.14±2.60① 47.83±5.10①②

圖7 熊果酸對Tca8113 細胞相關(guān)蛋白表達量的影響

表2 各時間點不同蛋白相對表達水平比較 （±s）

表2 各時間點不同蛋白相對表達水平比較 （±s）

組別 Bcl-2 Bax Cleaved Caspase-3 p-Fak Fak 0 h 1.302±0.045 0.242±0.013 0.131±0.003 0.738±0.039 0.775±0.064 1 h 1.063±0.059 0.323±0.009 0.209±0.009 0.583±0.019 0.709±0.044 3 h 0.836±0.036 0.468±0.010 0.292±0.008 0.528±0.020 0.623±0.026 6 h 0.724±0.031 0.552±0.020 0.357±0.012 0.508±0.020 0.571±0.027 12 h 0.615±0.041 0.747±0.038 0.462±0.019 0.273±0.016 0.186±0.009 24 h 0.576±0.033 0.931±0.049 0.529±0.032 0.163±0.008 0.113±0.008 F 值 131.910 255.415 236.973 259.171 180.578 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

熊果酸又名烏蘇酸，以與糖結(jié)合成苷或者游離的形式分布于多種植物中，有抗菌、降血糖等多種生物活性[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)熊果酸有抗腫瘤作用，通過對腫瘤細胞活性、凋亡、血管生成、遷移等多種生物學(xué)功能進行調(diào)控[10]，發(fā)揮抑制腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展的作用[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)其對舌癌Tca8113 細胞有抑制作用且呈濃度依賴性，提示熊果酸有抗腫瘤作用，與相關(guān)實驗研究結(jié)果[12-15]一致。在前列腺癌研究中，熊果酸通過ROCK/PTEN 介導(dǎo)Cofilin-1 線粒體定位，從而誘導(dǎo)前列腺癌細胞的凋亡[16]。本實驗結(jié)果表明，熊果酸對Tca8113 細胞具有促凋亡作用，且呈時間依賴性。細胞凋亡是由基因主導(dǎo)的細胞自發(fā)有序死亡過程，大致分為內(nèi)源性途徑和外源性途徑2 種，其中內(nèi)源性凋亡的核心環(huán)節(jié)是線粒體途徑，其過程包括抗凋亡因子Bcl-2 表達量減少，促凋亡因子Bax 的表達量增加并轉(zhuǎn)位線粒體，進一步調(diào)節(jié)Cyt C，使Cyt C 釋放入胞漿，激活Caspase-9 進而召集激活Caspase-3，引起Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，下游底物剪切被激活從而發(fā)生細胞凋亡[17]，其中Bcl-2 和Bax 的比值對內(nèi)源性凋亡有重大影響。本實驗結(jié)果表明，Tca8113 細胞經(jīng)熊果酸作用后Bax 表達量增強，而Bcl-2 表達量減弱，Bcl-2/Bax 比值降低，且Cleaved caspase-3 表達增強，提示熊果酸可誘導(dǎo)Tca8113 細胞的凋亡?？赏茰y熊果酸能促進Bax 等促凋亡基因表達而抑制Bcl-2 等抑凋亡基因表達，進而激活Caspase-3 引發(fā)其級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡。GAYATHRI 等[18]發(fā)現(xiàn)熊果酸能通過線粒體凋亡的途徑誘導(dǎo)白血病細胞K562 凋亡，與本研究結(jié)果相符。

腫瘤細胞的遷移與細胞外基質(zhì)黏附作用有關(guān)， Fak 是一種蛋白酪氨酸激酶，可調(diào)節(jié)各種類型細胞的黏附、運動、遷移和存活。Fak 在晚期癌癥中可通過與整合素、G 蛋白偶聯(lián)受體和細胞因子受體的相互作用而被激活，并促進癌癥進展和轉(zhuǎn)移[19]。在膠質(zhì)瘤研究中發(fā)現(xiàn)通過抑制Fak 表達，可抑制其遷移能力[20]。研究表明[21]，抑制乳腺癌細胞的Fak 后，其細胞遷移減少，降低了乳腺癌發(fā)生，并認為Fak 是通過維持腫瘤干細胞的量來促進癌癥的發(fā)生。Fak 激酶依賴性功能通常與局灶性黏連的整合素相關(guān)信號傳導(dǎo)相關(guān)，在正常細胞和癌細胞中的細胞遷移和黏附中起重要作用，其結(jié)構(gòu)位于Fak 的中間并含有活化環(huán)，酪氨酸（Y）位點Y576 和Y577，它們可被Src 磷酸化，可以抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[22]。活化的Fak 作為腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵信號介質(zhì)起著重要作用，表明Fak 是癌癥治療的潛在靶點[23]。本研究劃痕實驗結(jié)果表明，一定濃度熊果酸可對Tca8113 遷移起到抑制作用，同時經(jīng)熊果酸處理后p-Fak、Fak 表達下調(diào)，說明熊果酸可抑制Tca8113 細胞的遷移，這一結(jié)論與其在其他腫瘤中的現(xiàn)象一致[24-25]。

綜上所述，熊果酸作為一種天然植物中的三萜類化合物，能抑制舌癌Tca8113 細胞的體外活性，下調(diào)p-Fak、Fak 抑制其遷移，并通過促進Bax 表達、抑制Bcl-2 表達，誘導(dǎo)其凋亡。