徐少蓉，吳延，周孟君，賴婷，李丹，馬琴芹，路巍，李俊林，何瑋，李潤(rùn)，郭翠翠，張耀

(綿陽(yáng)市中心醫(yī)院，綿陽(yáng) 621000)

隨著現(xiàn)代社會(huì)環(huán)境的變化以及人們生活習(xí)慣的改變，不孕不育發(fā)生率逐年增加；自2016年二胎政策全面放開以來，有生育要求的高齡女性越來越多[1]。同時(shí)由于環(huán)境因素、遺傳因素、社會(huì)因素以及生活習(xí)慣和工作壓力等諸多因素的影響，卵巢儲(chǔ)備功能減退(DOR)患者的比例越來越高，在接受輔助生殖技術(shù)(ART)的不孕患者中約占10%[2]。高齡和DOR患者在體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)助孕時(shí)常表現(xiàn)為卵巢低反應(yīng)(POR)，控制性促排卵(COS)過程中容易出現(xiàn)促性腺激素(Gn)用量大、發(fā)育的卵泡少、獲卵數(shù)少的現(xiàn)象，導(dǎo)致臨床妊娠率降低、周期取消率升高[3]。為了有效解決上述問題，生殖領(lǐng)域醫(yī)生進(jìn)行了許多嘗試，比如應(yīng)用不同的降調(diào)節(jié)方案、給予不同的促排卵藥物劑量、添加雄激素[如脫氫表雄酮(DHEA)]或者小劑量的生長(zhǎng)激素(GH)以及采用中醫(yī)藥治療等，但目前仍沒有針對(duì)POR患者最佳助孕方案的臨床指南和共識(shí)，如何為這類患者選擇合適有效的COS方案，改善其促排卵結(jié)局，最終提高其臨床妊娠率，是目前輔助生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。

近年來Kuang等[4]進(jìn)行黃體期促排卵，未發(fā)生早發(fā)LH峰，并且獲得了理想的妊娠結(jié)局；該團(tuán)隊(duì)繼續(xù)對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能正常的不孕癥患者采用高孕激素狀態(tài)下促排卵方案(PPOS方案)發(fā)現(xiàn)，PPOS方案可以有效抑制早發(fā)LH峰，獲得理想的妊娠結(jié)局[5]。目前已有諸多研究證實(shí)PPOS方案應(yīng)用于POR、卵巢反應(yīng)正常以及高反應(yīng)人群，均能有效抑制早發(fā)LH峰并獲得較理想的臨床結(jié)局[6-12]，尤其在POR患者中更具優(yōu)勢(shì)，但該觀點(diǎn)尚缺乏大樣本多中心研究支持，且PPOS方案在各生殖中心的臨床應(yīng)用尚不廣泛，其衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)效益等仍有待進(jìn)一步研究。因此，本研究采用前瞻性研究的方法，對(duì)POR患者分別應(yīng)用PPOS方案與微刺激方案促排卵，比較兩種方案的促排卵結(jié)局和胚胎實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，旨在探討PPOS方案應(yīng)用于POR患者的臨床價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2017年9月至2019年12月在我院生殖醫(yī)學(xué)中心接受IVF/ICSI-ET助孕治療的POR患者的臨床資料(共74個(gè)周期)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2011年歐洲人類胚胎與生殖學(xué)會(huì)(ESHER)和美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)(ASRM)在意大利博洛尼亞討論并制定的POR診斷共識(shí)[13]：(1)年齡≥40歲或存在卵巢反應(yīng)不良的其它危險(xiǎn)因素；(2)前次IVF周期出現(xiàn)POR，常規(guī)促排卵方案獲卵數(shù)≤3個(gè)；(3)卵巢儲(chǔ)備功能下降：基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC)<5～7個(gè)或抗苗勒管激素(AMH)<0.5～1.1 mg/L；如果年齡<40歲或卵巢儲(chǔ)備功能檢測(cè)正常，患者連續(xù)2個(gè)周期應(yīng)用最大化的卵巢刺激方案仍出現(xiàn)POR也可診斷；至少滿足以上3條中的2條即可診斷為POR。所有患者均符合《人類輔助生殖技術(shù)規(guī)范》的適應(yīng)證并排除禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫妻任何一方患有嚴(yán)重的精神疾患、泌尿生殖系統(tǒng)急性感染、性傳播疾?。?2)患有《母嬰保健法》規(guī)定的不宜生育、目前無法進(jìn)行產(chǎn)前診斷或胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)的遺傳性疾?。?3)夫妻任何一方有吸毒等嚴(yán)重不良嗜好；(4)夫妻任何一方接觸致畸量的射線、毒物、藥品并處于作用期；(5)女方子宮不具備妊娠功能或患有嚴(yán)重軀體疾病不能承受妊娠。

本研究所有納入的患者由同一高年資醫(yī)師進(jìn)行溝通，患者在充分知情理解后自愿選擇PPOS方案或微刺激方案，并簽署治療同意書。本研究取得我院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核同意。

按照COS方案不同將研究對(duì)象分為兩組：PPOS組(55個(gè)周期)和微刺激組(19個(gè)周期)。

二、研究方法

1.COS方案：(1)PPOS方案：在月經(jīng)周期第2～3天開始給予安宮黃體酮(浙江仙琚制藥)10 mg/d至扳機(jī)日，同時(shí)根據(jù)患者年齡、體重指數(shù)(BMI)、AFC、AMH、基礎(chǔ)FSH(bFSH)、bFSH/bLH比值和既往促排卵卵巢反應(yīng)情況，開始使用麗申寶(珠海麗珠制藥)和/或HMG(珠海麗珠制藥)150～300 U/d，促排治療4 d后行陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，同時(shí)監(jiān)測(cè)血清FSH、LH、E2、P水平，并根據(jù)血清性激素水平和卵泡發(fā)育情況調(diào)整促排卵藥物的劑量。(2)微刺激方案：在月經(jīng)周期第2～3天開始給予克羅米芬(高特制藥，塞浦路斯)50～100 mg或來曲唑(江蘇恒瑞醫(yī)藥)2.5～5.0 mg口服5 d，5 d后行陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，同時(shí)監(jiān)測(cè)血清性激素水平，并根據(jù)血清性激素水平和卵泡發(fā)育情況增加或不增加麗申寶和/或HMG 150～300 U/d，如血清LH水平超過bLH水平2倍以上，或卵泡直徑≥14 mm，則皮下注射促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRH-ant，默沙東，美國(guó))抑制早發(fā)LH峰。

兩組患者中當(dāng)有1個(gè)以上直徑≥20 mm的卵泡或者3個(gè)以上直徑≥18 mm的卵泡時(shí)，當(dāng)晚給予重組人絨毛膜促性腺激素(rHCG，艾澤，默克雪蘭諾，意大利)250 μg扳機(jī)，36 h后取卵。

2.取卵及IVF：在陰道超聲引導(dǎo)下行取卵術(shù)，依次抽吸所有直徑10 mm以上的卵泡。IVF方式根據(jù)男方精液情況和既往受精情況評(píng)估決定，行常規(guī)IVF或ICSI受精。按照本中心常規(guī)操作進(jìn)行胚胎培養(yǎng)，并根據(jù)胚胎發(fā)育過程中卵裂球大小、形態(tài)及碎片比例等指標(biāo)將卵裂期胚胎分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)[14]：Ⅰ級(jí)胚胎：卵裂球大小均勻，形狀規(guī)則，透明帶完整；胞質(zhì)均質(zhì)、清晰；胚胎內(nèi)碎片≤5%。Ⅱ級(jí)胚胎：卵裂球大小略不均勻，形狀略不規(guī)則；胞質(zhì)均勻或存在少量空泡；碎片6～20%。Ⅲ級(jí)胚胎：卵裂球大小明顯不均勻，可有明顯的形狀不規(guī)則；胞質(zhì)可有明顯顆?；虼罅靠张?；碎片20～50%。Ⅳ級(jí)胚胎：細(xì)胞大小嚴(yán)重不均勻；胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象，變黑，或有大量空泡；碎片超過50%。將來源于正常受精卵，且受精后第3天胚胎細(xì)胞數(shù)7～9個(gè)，評(píng)分為Ⅰ～Ⅱ級(jí)的胚胎定義為D3優(yōu)質(zhì)胚胎；將來源于0PN、1PN、2PN的受精卵，受精后D3胚胎細(xì)胞數(shù)4～11個(gè)，評(píng)分為Ⅰ～Ⅲ級(jí)的胚胎定義為D3可利用胚胎。

因PPOS方案與微刺激方案均影響子宮內(nèi)膜容受性，故全部取消新鮮周期移植，行全胚胎冷凍，擇期行凍融胚胎移植(FET)。

3. FET及妊娠判斷：所有解凍周期患者均選擇激素替代治療(HRT)準(zhǔn)備內(nèi)膜，于月經(jīng)周期第3天起，口服天然雌激素，起始劑量4 mg/d，每4 d增加劑量2 mg/d，至8 mg/d，通常雌激素使用時(shí)間≥12 d。當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時(shí)，參考當(dāng)日血清E2、P水平，給予黃體酮注射液(浙江仙琚制藥)60 mg/d或黃體酮陰道緩釋凝膠(默克雪蘭諾，美國(guó))90 mg/d。孕激素用藥第4日移植D3胚胎，第6日移植D5/D6囊胚，移植后繼續(xù)使用雌孕激素，可添加地屈孕酮(雅培，荷蘭)20 mg/d，行黃體支持至孕12周。移植后12/14日測(cè)血β-HCG值≥25 U/L確定生化妊娠，移植后28/30日B超見孕囊者確定為臨床妊娠。

4.觀察指標(biāo)：主要評(píng)價(jià)指標(biāo)有：早發(fā)LH峰發(fā)生情況、獲卵數(shù)、MⅡ卵率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可利用胚胎率等。早發(fā)LH峰指扳機(jī)前LH>10 U/L。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組患者一般資料比較

經(jīng)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)顯示，PPOS組和微刺激組患者的年齡、不孕年限、BMI、AMH、AFC、bFSH、bLH、bE2等比較均無顯著性差異(P>0.05)，提示兩組患者具有可比性(表1)。

表1 兩組患者一般情況比較[M(P25，P75)]

二、兩組患者促排卵情況比較

經(jīng)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)顯示，PPOS組的Gn天數(shù)、Gn總量、HCG日E2水平、HCG日≥14 mm卵泡數(shù)顯著高于微刺激組(P<0.05)；PPOS組HCG日LH水平顯著低于微刺激組(P<0.05)；兩組HCG日P水平比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。PPOS組無早發(fā)LH峰出現(xiàn)，微刺激組發(fā)生2例早發(fā)LH峰。

三、兩組患者胚胎實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

PPOS組獲卵數(shù)顯著高于微刺激組(3.0 vs. 2.0)(P<0.05)；PPOS組與微刺激組的MⅡ卵率(94.6% vs. 95.5%)、正常受精率(67.7% vs. 64.3%)、卵裂率(97.0% vs. 97.4%)、優(yōu)質(zhì)胚胎率(46.8% vs. 29.6%)、可利用胚胎率(69.8% vs. 52.6%)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表2 兩組患者促排卵情況比較[M(P25，P75)]

表3 兩組患者胚胎實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較[M(P25，P75)，%]

四、兩組患者臨床妊娠情況

PPOS組行HRT-FET共37個(gè)周期，臨床妊娠6例，其中宮內(nèi)單胎5例，宮內(nèi)雙胎1例，活產(chǎn)1例健康男嬰，其余5例至文章撰寫時(shí)尚未分娩；微刺激組行HRT-FET共11個(gè)周期，臨床妊娠3例，全是宮內(nèi)單胎，至文章撰寫時(shí)尚未分娩。因樣本量少，且至撰文時(shí)微刺激組尚未有妊娠結(jié)局，因此未對(duì)兩組的妊娠結(jié)局進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

討 論

POR在人群中的發(fā)病率越來越高，尤其在≥40歲的高齡女性中發(fā)生率超過50%[15]，POR患者在助孕過程中對(duì)Gn反應(yīng)差，用藥劑量大，獲卵少，胚胎質(zhì)量差，促排卵效果不理想，難以獲得理想的妊娠結(jié)局[16]。目前在臨床工作中，微刺激方案、拮抗劑方案、自然周期和短效長(zhǎng)方案等均有應(yīng)用于POR患者，但降調(diào)節(jié)方案可能導(dǎo)致卵巢過度抑制，導(dǎo)致Gn用量大、用藥時(shí)間長(zhǎng)，藥物耗費(fèi)高，用藥復(fù)雜等現(xiàn)象。自然周期、微刺激方案以及拮抗劑方案雖然簡(jiǎn)單，但無法完全避免早發(fā)LH峰導(dǎo)致的周期取消，卵泡早期LH升高還可能會(huì)對(duì)卵子質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響[17]。因此尋找合適的COS方案，盡快獲取高質(zhì)量的卵子和胚胎，是改善POR患者臨床結(jié)局的關(guān)鍵。本研究分析了POR患者使用PPOS方案(55個(gè)周期)的臨床療效，研究結(jié)果顯示PPOS方案可以明顯改善卵巢的反應(yīng)性，同時(shí)有效抑制早發(fā)LH峰，不失為POR患者的一種可選促排卵方案。PPOS方案的有效機(jī)制是在雌激素水平上升前給予孕激素，使下丘腦孕激素化，以阻斷雌激素誘導(dǎo)的正反饋?zhàn)饔?，抑制早發(fā)LH峰的發(fā)生；且該方案不干擾下丘腦GnRH受體功能，并不抑制垂體Gn的脈沖式分泌。同時(shí)，孕激素具有拮抗雌激素的作用，該作用對(duì)于臨床常見的雌激素依賴性疾病(如子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤等)具有一定的緩解作用[18]。

PPOS方案臨床運(yùn)用的有效性已被較多研究證實(shí)。張欣等[6]研究顯示PPOS方案在高齡患者中能顯著提高卵母細(xì)胞受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率。沈秀等[7]將PPOS方案應(yīng)用于FSH升高的DOR患者，發(fā)現(xiàn)其能有效抑制LH峰，提高優(yōu)質(zhì)胚胎率。葉靜等[8]在卵巢功能正?；颊咧袘?yīng)用PPOS方案，發(fā)現(xiàn)其獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、可利用胚胎數(shù)及隨后FET周期中的臨床妊娠率等均與短方案相似。楊菁等[9]發(fā)現(xiàn)PPOS方案在POR患者中能較好地抑制早發(fā)LH峰，增加可移植胚胎率。郭麗娜等[10]對(duì)長(zhǎng)方案促排后助孕未獲成功的卵巢正常反應(yīng)患者應(yīng)用PPOS方案發(fā)現(xiàn)，PPOS方案可以改善胚胎質(zhì)量，獲得較好的臨床妊娠結(jié)局。顏曉紅等[11]認(rèn)為PPOS方案不僅經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，且其應(yīng)用于POR患者可以有效抑制早發(fā)LH峰，獲得滿意的胚胎質(zhì)量。本研究中，PPOS方案的獲卵數(shù)顯著優(yōu)于微刺激方案，證明PPOS方案能改善POR患者的卵巢反應(yīng)性。PPOS組患者均無早發(fā)LH峰出現(xiàn)，微刺激組2例患者出現(xiàn)早發(fā)LH峰，證明PPOS方案能有效抑制早發(fā)LH峰。兩組方案的MⅡ卵率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率等比較均無顯著性差異。

PPOS方案持續(xù)應(yīng)用外源性孕激素是否會(huì)對(duì)卵子質(zhì)量造成影響進(jìn)而威脅子代安全，是生殖醫(yī)師關(guān)注的重點(diǎn)。Venetis等[19]對(duì)60 000多個(gè)促排卵周期的資料行Meta分析表明，高孕激素水平主要影響本次促排周期的子宮內(nèi)膜容受性，對(duì)卵泡發(fā)育和胚胎質(zhì)量并無明顯影響。Zhang等[20]對(duì)PPOS方案促排卵獲得的新生兒(n=1 931)隨訪后觀察到，與傳統(tǒng)的短方案(n=1 658)和微刺激方案(n=1 007)相比，PPOS方案促排卵后獲得的新生兒在不良出生結(jié)局和畸形率等方面的風(fēng)險(xiǎn)并沒有增加。Chen等[21]回顧性分析587例新生兒的出生缺陷發(fā)生情況，證明了黃體期促排卵的子代安全性，而PPOS方案與黃體期促排卵方案均是高孕激素狀態(tài)下促排卵，且PPOS方案更接近生理性卵泡生長(zhǎng)。但因?yàn)楸狙芯繕颖玖坑邢?，還有一部分患者的胚胎未移植，移植并妊娠的患者中僅PPOS組分娩1例健康男嬰，微刺激方案中獲得臨床妊娠的患者至撰文時(shí)尚未分娩，故本研究無法驗(yàn)證PPOS方案的子代健康問題。

近年來隨著FET技術(shù)的不斷成熟，凍融胚胎復(fù)蘇率逐年升高，提示凍融胚胎的質(zhì)量及發(fā)育潛力未受到明顯影響。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究證實(shí)了FET技術(shù)的安全性[22-25]，為PPOS方案全胚冷凍提供了技術(shù)支持。總之，PPOS方案作為一種新型、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、有效的方案，簡(jiǎn)化了促排卵過程，且能有效抑制早發(fā)LH峰，降低周期取消率，改善卵巢反應(yīng)性，是一種適合POR患者的臨床促排卵方案，但仍需多中心大樣本的臨床研究進(jìn)一步觀察驗(yàn)證，以期不斷完善和優(yōu)化PPOS方案，使其更好地應(yīng)用于臨床治療。