周昂摺，周巧婷，周恩牧，金建忠

（浙江樹(shù)人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015）

波羅蜜Artocarpus heterophyllus為桑科Moraceae 波羅蜜屬Artocarpus植物，是典型的熱帶果樹(shù)，原產(chǎn)于印度，現(xiàn)在我國(guó)廣東、廣西、海南、云南、福建和四川南部的熱帶、南亞熱帶地區(qū)均有栽培[1]。波羅蜜果肉爽脆、蜜甜、芳香味濃，肉色橙黃鮮艷，富含糖、蛋白質(zhì)、維生素A、維生素C 以及人體所必須的鉀、鈣、鋅等元素[2]。目前，對(duì)波羅蜜加工利用的部分主要是其果肉，而其果皮和種子通常被當(dāng)作廢棄物丟棄，這不但浪費(fèi)資源，而且對(duì)環(huán)境造成污染[3]。波羅蜜種子呈橢圓形，不僅富含淀粉，還含有脂肪、揮發(fā)油、多酚、蛋白質(zhì)和纖維素等，是有待開(kāi)發(fā)加工利用的新資源[4]。目前，對(duì)波羅蜜種子的研究主要集中在其淀粉特性及提取制備上[4]，對(duì)其多酚的研究較少[5]。植物多酚亦稱植物單寧，其在抗氧化、抗突變、抗腫瘤等很多方面具有突出作用和廣泛的保健功能，其中，最重要的是抗氧化功能[6]?，F(xiàn)有對(duì)植物多酚的提取方法主要有溶劑提取法[7-9]、離子沉淀法[10-12]、超聲波輔助提取法[13-14]、微波輔助提取法[15-16]、生物酶提取法[17-19]、超臨界CO2提取法[21-22]等。本文以波羅蜜種子為研究對(duì)象，采用超聲波輔助萃取技術(shù)提取多酚，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以期為波羅蜜種子開(kāi)發(fā)新的利用方向，減少環(huán)境污染。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

沒(méi)食子酸，福林酚試劑，無(wú)水Na2CO3，95%乙醇（分析純）；波羅蜜種子（購(gòu)自廣東湛江，為當(dāng)年生種子）。

1.2 儀器與設(shè)備

LSA-E24/1200 超聲波清洗器（杭州法蘭特超聲波科技有限公司），Evolution 201 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(中國(guó)Thermo)，AB204-N 電子天平（美國(guó)奧豪斯）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超聲波輔助萃取方法 將在100℃干燥至恒質(zhì)量的波羅蜜種子直接粉碎并過(guò)30 目篩，獲得波羅蜜種子粉末。精確稱取0.400 0 g 波羅蜜種子粉末于25 mL 比色管中，首先固定超聲時(shí)間為40 min，料液比為1∶50（g·mL-1），超聲功率為85 W，超聲溫度為50℃，改變乙醇濃度進(jìn)行乙醇濃度單因素試驗(yàn)，當(dāng)溫度達(dá)到設(shè)定值時(shí)將比色管放入儀器中超聲萃取，超聲結(jié)束后過(guò)濾得提取液。確定最佳乙醇濃度后再依次進(jìn)行其他因素的試驗(yàn)。

為了全面考察超聲波輔助萃取波羅蜜種子多酚時(shí)各因素對(duì)其的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。考察超聲溫度（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲功率（C）、料液比（D）和乙醇濃度（E）五個(gè)因素對(duì)波羅蜜種子多酚產(chǎn)量的影響，選用L16(45)正交表，考察因素、水平及正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 1 Result of orthogonal test and analysis

1.3.2 多酚的測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確吸取40 μg·mL-1沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL 分別置于6 支25 mL 具塞比色管中，依次加入8.75 mL 的20%福林酚試劑、5.00 mL7.5%的Na2CO3溶液，加水定容，放置40 min 后以空白樣品為參比溶液，在760 nm 波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。以濃度（C）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：

1.3.2.2 最佳波長(zhǎng)的選擇 按1.3.2.1 的測(cè)定方法分別測(cè)定沒(méi)食子酸和波羅蜜種子多酚提取液的吸收曲線，見(jiàn)圖1。由圖1 可知，沒(méi)食子酸和波羅蜜種子多酚提取液經(jīng)顯色反應(yīng)后的光譜曲線形狀相似，均在760 nm 處有最大吸收。所以，測(cè)定波羅蜜種子多酚含量可以用沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，同時(shí)，以760 nm 為最佳波長(zhǎng)。

1.3.2.3 波羅蜜種子多酚的測(cè)定 將超聲波輔助萃取所得的多酚提取液置于25 mL 容量瓶，用水定容，移取上述樣品溶液1.25 mL 于25 mL 具塞比色管，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定其吸光度，由沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程計(jì)算出比色管中波羅蜜種子多酚提取液的濃度C，并計(jì)算波羅蜜種子中多酚的產(chǎn)量，其方程如下：

圖1 沒(méi)食子酸和波羅蜜種子多酚吸收曲線Figure 1 Absorption curves of gallic acid and polyphenols

1.4 數(shù)據(jù)分析

圖表數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用Graphpad Prism 軟件，正交設(shè)計(jì)及分析采用正交設(shè)計(jì)助手軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 波羅蜜種子多酚的超聲波輔助萃取單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)波羅蜜種子多酚提取量的影響 固定超聲時(shí)間40 min，料液比1∶50，超聲功率85 W，超聲溫度50℃，控制乙醇濃度分別為60%，65%，70%，75%，80%時(shí)進(jìn)行萃取，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2 可知，波羅蜜種子多酚提取量隨著乙醇濃度的升高呈先增加后降低的趨勢(shì)，在乙醇濃度為60%～ 70%時(shí)，提取效果呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，到70%時(shí)提取效果為最佳，多酚提取產(chǎn)量達(dá)3.688 mg·g-1；當(dāng)乙醇濃度高于70%時(shí)，提取效果逐漸下降。

2.1.2 超聲溫度對(duì)波羅蜜種子多酚提取的影響 固定乙醇濃度為70%，料液比為1∶50，超聲時(shí)間為40 min，超聲功率為85 W，控制超聲溫度分別為35℃，40℃，45℃，50℃，55℃時(shí)進(jìn)行波羅蜜種子多酚提取，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3 可知，隨著處理溫度的逐漸上升，提取效果呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在超聲溫度在35～ 45℃時(shí)，提取效果呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到45℃時(shí)提取效果最佳，多酚提取產(chǎn)量達(dá)3.938 mg·g-1。當(dāng)溫度高于45℃時(shí)，提取效果呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)闇囟冗^(guò)低，乙醇提取波羅蜜種子多酚不完全，但溫度過(guò)高酒精揮發(fā)量增多，使提取效果降低。

圖2 乙醇濃度對(duì)波羅蜜種子多酚提取量的影響Figure 2 Effect of ethanol concentration on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

圖3 超聲溫度對(duì)波羅蜜種子多酚提取量的影響Figure 3 Effect of ultrasonic temperature on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

2.1.3 料液比對(duì)波羅蜜種子多酚提取量的影響 固定超聲溫度為45℃，乙醇濃度為70%，超聲時(shí)間為40 min，超聲功率為85 W，控制波羅蜜種子粉末和乙醇的料液比分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 時(shí)進(jìn)行提取，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4 可知，隨著乙醇用量的增多，提取效果呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)料液比達(dá)到1:40 時(shí)提取效果達(dá)到最佳，為3.952 mg·g-1。當(dāng)料液比低于1∶40 時(shí)，提取效果基本保持不變。這是因?yàn)樵谝掖加昧窟_(dá)到一定量時(shí)，加入的乙醇所能提取出多酚的量已經(jīng)達(dá)到飽和，當(dāng)乙醇用量繼續(xù)增加，料液比達(dá)到1∶40 時(shí)，其樣品中的多酚最大限度的被提取出來(lái)，所以料液比低于1∶40 后提取效果基本不變。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)波羅蜜種子多酚提取量的影響 在超聲溫度為45℃，料液比為1∶40，乙醇濃度為70%，超聲功率為85 W，超聲時(shí)間分別為10 min，20 min，30 min，40 min，50 min 時(shí)進(jìn)行波羅蜜種子多酚提取，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5 可知，隨著超聲時(shí)間的增加，提取效果呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間在10～ 30 min 時(shí)，提取效果呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30 min 時(shí)，提取效果達(dá)到最佳，為4.275 mg·g-1；當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)30 min時(shí)提取效果有所降低，這是因?yàn)榍?0 min 是隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，其提取越完全，但超過(guò)30 min 后隨著超聲時(shí)間的增加，其提取液中的乙醇揮發(fā)量增大，使其提取液中的有效乙醇濃度降低，從而使多酚提取量減少。

圖4 料液比對(duì)波羅蜜種子多酚提取量的影響Figure 4 Effect of solid-liquid ratio on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

圖5 超聲時(shí)間對(duì)波羅蜜種子多酚提取量的影響Figure 5 Effect of ultrasonic time on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

2.1.5 超聲功率對(duì)波羅蜜種子多酚提取量的影響 固定超聲時(shí)間為30 min，料液比為1∶40，超聲溫度為45℃，乙醇濃度為70%，改變超聲功率分別為55 W，65 W，75 W，85 W，95 W 時(shí)進(jìn)行提取，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6 可知，隨著超聲功率的增大，空化強(qiáng)度增大，多酚提取量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率達(dá)到65 W 時(shí)，提取效果達(dá)到最佳，為5.030 mg·g-1。但超聲功率過(guò)高會(huì)產(chǎn)生大量的無(wú)用氣泡，增加散射衰減，形成聲屏障，同時(shí)也會(huì)增加非線性衰減，故當(dāng)超聲功率高于65 W 時(shí)多酚提取量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.2 超聲波輔助萃取波羅蜜種子多酚的正交試驗(yàn)

由正交試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表1）表明，波羅蜜種子多酚的超聲波輔助萃取各因素對(duì)多酚產(chǎn)量影響程度的大小順序?yàn)椋篍＞A＞D＞C＞B。最佳提取條件為A3B1C1D4E1，即超聲溫度為45℃、超聲時(shí)間為10 min、超聲功率為55 W、料液比為1∶50、乙醇濃度為60%。

由表2 的方差分析結(jié)果表明，超聲波輔助萃取各因素對(duì)多酚產(chǎn)量影響程度的大小順序?yàn)椋篍＞A＞D＞C＞B，與表1 的直觀分析結(jié)果一致，且各因素的F值＜F0.05（3，3），表明各萃取條件對(duì)多酚產(chǎn)量的影響都不顯著。

圖6 超聲功率對(duì)波羅蜜種子多酚提取量的影響Figure 6 Effect of ultrasonic power on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交實(shí)驗(yàn)所得的最佳萃取條件下重復(fù)萃取波羅蜜種子3 次，所得多酚的產(chǎn)量分別為5.261 mg·g-1，5.395 mg·g-1，5.451 mg·g-1，平均產(chǎn)量為5.368 mg·g-1。此提取條件與正交試驗(yàn)任意組對(duì)比，均大于各組萃取量，驗(yàn)證了所確定條件為最佳工藝條件。

3 結(jié)論

本文采用超聲波輔助萃取了波羅蜜種子中的多酚，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察了超聲時(shí)間、超聲溫度、乙醇濃度、料液比、超聲功率5 種因素對(duì)波羅蜜種子多酚產(chǎn)量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)波羅蜜種子多酚產(chǎn)量影響的大小順序?yàn)椋阂掖紳舛龋境暅囟龋境暪β剩玖弦罕龋境晻r(shí)間；其最佳萃取工藝條件為：超聲溫度45℃、超聲時(shí)間10 min、超聲功率55 W、料液比1∶50、乙醇濃度60%，在此條件下波羅蜜種子多酚產(chǎn)量達(dá)5.368 mg·g-1。但該工藝的料液比過(guò)低，在工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)會(huì)造成濃縮能耗過(guò)大的問(wèn)題，有待進(jìn)一步研究解決。