李 杰，楊育儒，王慶芬，陳錦珊 （中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇九醫(yī)院 / 廈門(mén)大學(xué)附屬東南醫(yī)院藥劑科，福建 漳州，363000）

防暑清熱飲是由廣藿香、白茅根、菊花、薄荷、枸杞等藥材配伍而成的中藥復(fù)方制劑。方中廣藿香為君藥，白茅根、菊花為臣藥，薄荷為佐藥，枸杞為使藥，諸藥合用，具有芳香化濕、清熱解毒、解渴生津之功效[1]。課題組前期已采用紫外分光光度法對(duì)防暑清熱飲中總多糖和總黃酮進(jìn)行質(zhì)量控制[2]。為了更為全面地控制防暑清熱飲的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)參考現(xiàn)有文獻(xiàn)[3-16]，采取RP-HPLC 法同時(shí)測(cè)定方中多個(gè)活性成分含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（AngiLent 1200 型，DAD 檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司），分析天平（AUX220，日本島津公司）。防暑清熱飲（批號(hào)：20200120，202002101，202002102，規(guī) 格：100 ml/瓶，第九〇九醫(yī)院藥劑科），綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-200413）、3，5-O-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)：111782-201807）、蒙花苷（批號(hào)：111528-201710）和廣藿香酮（批號(hào)：111822-201904）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷（批號(hào)：GZDD-0115，貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司），甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為純化水。

2 含量測(cè)定

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性

色譜柱ZORBAX-SB-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫0～30 min，88%～82%A；30～45 min，82%～78%A；45～65 min，78%～35%A；65～75 min，35%A；75～78 min，35%～30%A；78～80 min，30%～88%A；80～82 min，88%A；流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量20 μl，理論塔板數(shù)按3，5-O-二咖啡酰奎寧酸計(jì)算應(yīng)不低于8 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液

分別精密稱(chēng)定綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品適量，置于同一10 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋成每1 ml 中含綠原酸2.15 mg、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷1.05 mg、3，5-O-二咖啡?？鼘幩?.00 mg。分別精密稱(chēng)定蒙花苷和廣藿香酮對(duì)照品適量置于同一25 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋成每1 ml中含蒙花苷0.21 mg 和廣藿香酮0.05 mg，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液5 ml，置同一25 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對(duì)照品母液。

2.2.2 供試品溶液

精密量取防暑清熱飲5 ml，置10 ml 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液

按處方量制備不含廣藿香、白茅根、菊花和薄荷的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專(zhuān)屬性考察

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果陰性溶液無(wú)干擾，方法專(zhuān)屬性良好，見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品母液按比例稀釋?zhuān)谏鲜錾V條件下，分別進(jìn)樣20 μl，以質(zhì)量濃度X（μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程，見(jiàn)表1。

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜峰面積，綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡?？鼘幩帷⒚苫ㄜ?、廣藿香酮峰面積的RSD 分別為0.29%、0.30%、0.32%、0.45%、0.45%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份（批號(hào)：20200120），并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果顯示，防暑清熱飲中綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡?？鼘幩?、蒙花苷、廣藿香酮峰面積的RSD 分別為0.56%、0.68%、0.70%、0.94%、1.75%，表明方法重復(fù)性良好。

表1 回歸方程及線性范圍

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將供試品溶液在室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣20 μl，記錄色譜峰面積，結(jié)果顯示，防暑清熱飲中綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡酰奎寧酸、蒙花苷、廣藿香酮峰面積的RSD 分別為0.64%、1.16%、0.71%、0.59%、1.36%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的防暑清熱飲2.5 ml，共6 份，置10 ml 容量瓶中，再分別精密加入對(duì)照品適量，加水稀釋至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，進(jìn)樣20 μl，記錄峰面積，測(cè)定其含量，計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 樣品測(cè)定

取3 個(gè)批號(hào)的防暑清熱飲樣品（批號(hào)：20200120，202002101，202002102），各3 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備防暑清熱飲供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，進(jìn)樣20 μl，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明廣藿香酮具有抗菌、抗炎、抗氧化、殺蟲(chóng)以及抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)等多種生物活性；綠原酸、3，5-O-二咖啡?？鼘幩釋儆诒奖仡?lèi)化合物，具有解熱鎮(zhèn)痛、抗氧化作用；木犀草素-7-O-D-葡糖苷和蒙花苷屬于黃酮類(lèi)化合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、抑菌抗病毒等作用。對(duì)單味藥材進(jìn)行分析，廣藿香中含有廣藿香酮；菊花、廣藿香、白茅根和薄荷均含有綠原酸；菊花中含有3，5-O-二咖啡?？鼘幩幔痪栈ê捅『芍泻忻苫ㄜ?。中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，在保證達(dá)到檢測(cè)要求的條件下，綜合考慮選擇綠原酸、木犀草素-7-Oβ-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡酰奎寧酸、蒙花苷、廣藿香酮作為液相色譜法檢測(cè)的指標(biāo)性成分[17-21]。

表2 防暑清熱飲加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 3 批防暑清熱飲含量測(cè)定結(jié)果（n=3, μg/ml）

本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸4 個(gè)洗脫溶劑系統(tǒng)作為流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%磷酸作為流動(dòng)相色譜峰時(shí)，峰形和分離效果較好，梯度洗脫比等度洗脫分離更好。由于本品為水溶性溶液，被測(cè)活性成分極性相對(duì)較大，故使流動(dòng)相起始和結(jié)束比例保持一致，即乙腈-0.2%磷酸（12∶88），以確保所測(cè)成分在正確的保留時(shí)間出峰。

在190～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，廣藿香酮、3，5-O-二咖啡酰奎寧酸、蒙花苷、綠原酸和木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷最大吸收波長(zhǎng)分別為308、327、330、325 和348 nm，綜合考慮選擇327 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)供試品溶液制備簡(jiǎn)便，由于本品為液體制劑，用水稀釋后直接進(jìn)樣，在該色譜條件下無(wú)干擾，故考慮稀釋后直接進(jìn)樣。

本實(shí)驗(yàn)建立的含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，可作為防暑清熱飲的質(zhì)控方法，因不同批次有效成分含量相差較大，考慮可能是藥材受產(chǎn)地或采收季節(jié)的影響，也可能是該制劑提取工藝穩(wěn)定性的問(wèn)題，還需進(jìn)一步考察，后續(xù)需要經(jīng)過(guò)多批次測(cè)定以確定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。