王彥改，沈 芊，蘇，王雪梅，姜德春，閆素英（首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100053）

替考拉寧對革蘭陽性菌，特別是對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantstaphylococcus aureus，MRSA）造成的感染有很好的療效[1]。替考拉寧治療革蘭陽性菌感染的療效與萬古霉素相當(dāng)，但替考拉寧在相同條件下比萬古霉素安全性更高[2]，其更容易滲透入組織和細胞，半衰期延長，肌內(nèi)注射能良好的吸收[3]，臨床主要用于多重耐藥革蘭陽性菌感染。有研究[4]表明，在臨床應(yīng)用過程中，有近70%的患者未達到最佳治療濃度，而增加劑量會有不良反應(yīng)的發(fā)生[5]，因此有必要進行血藥濃度監(jiān)測，以保證療效，降低不良反應(yīng)。替考拉寧的含量測定方法包括HPLC法[6-9]、LC-MS法[10]和熒光免疫偏振法[11]，其中HPLC法在生物樣品含量測定方面的應(yīng)用較多，檢測波長多設(shè)在210～220 nm，本研究采用240 nm檢測波長，以減少血漿中物質(zhì)的干擾，提高檢測的準(zhǔn)確性。本研究擬通過建立靈敏、簡單、快捷的替考拉寧血藥濃度監(jiān)測方法，為臨床替考拉寧合理應(yīng)用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（日本島津公司），包括：LC-20AD二元泵、SIL-20AC進樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-20A檢測器、LabSolutions工作站；Biofuge pico離心機（德國賀力氏儀器公司）；旋渦混合器VORTEX-5（中國其林貝爾公司）；GZ-1多用震蕩器（北京電機廠）；?？艱CY-24S氮氣吹干儀（青島?？苾x器有限公司）；XS205天平[瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 試藥

替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，純度/效價：每毫克相當(dāng)于894單位，批號：130374-201002）。哌拉西林鈉標(biāo)準(zhǔn)品[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度：98.0%，批號：5C80B-NE]。乙腈和甲醇均為HPLC級（美國Fisher公司）；磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸（H3PO4）、二氯甲烷（CH2Cl2）均為分析純（北京化工廠）。注射用替考拉寧（規(guī)格：200 mg，生產(chǎn)廠家：Sanofi-aventis S.p.A公司，批號：8714）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：kromasil ODS C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀水溶液（25∶75，v/v），流速1.0 mL·min-1，柱溫35 ℃，進樣池溫度4 ℃，進樣體積 20 μL，檢測波長240 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)控樣本的配制

2.2.1 替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品10.04 mg，用滅菌注射用水溶解后轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中定容，即配制成質(zhì)量濃度為2.01 mg·mL-1的儲備液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取哌拉西林鈉對照品2.55 mg，用滅菌注射用水溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶定容，即得質(zhì)量濃度為255 μg·mL-1的哌拉西林鈉內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制 精密吸取替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，加入空白血漿950 μL配制成濃度為100.00 μg·mL-1的樣品A，取空白血漿依次等比例（1∶1）稀釋，配制成濃度分別為50.00、25.00、12.50、6.25、3.12 μg·mL-1的樣品B、C、D、E、F。

2.2.4 質(zhì)控樣品配制 精密吸取替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，加入空白血漿950 μL配制成濃度為100.00 μg·mL-1的樣品A，取空白血漿依次等比例（1∶2）稀釋，配制成濃度分別為33.33、11.11、3.70 μg·mL-1的高濃度質(zhì)控樣品、中濃度質(zhì)控樣品、低濃度質(zhì)控樣品。

2.2.5 0.01 mol·L-1KH2PO4緩沖溶液 準(zhǔn)確稱取1.360 1 g KH2PO4轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入1000 mL滅菌注射用水。充分混勻，獲得0.01 mol·L-1KH2PO4溶液,加入H3PO4調(diào)pH值2.8，抽濾待用。

2.3 血漿樣品處理方法

取空白血漿、標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控血漿樣品400 μL置于1.5 mL離心管中，加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液（255 μg·mL-1），加入乙腈600 μL，渦旋1 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液于另一1.5 mL離心管中，再加入400 μL二氯甲烷萃取，渦旋1 min，12 000 r·min-1離心5 min后，取上清液進樣分析，進樣量20 μL。

where ω is the central angular frequency. Based on Eqs. (2)and (3), the parameter values of C1 and L can be obtained as,

2.4 方法學(xué)驗證

方法學(xué)考察按照2015版藥典中的生物樣品定量分析指導(dǎo)原則[12]進行，包括專屬性、殘留效應(yīng)、定量下限、標(biāo)準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性。

2.4.1 專屬性考察 分別制備空白血漿樣品、空白血漿+內(nèi)標(biāo)溶液（internal standard，IS）、替考拉寧最低定量下限（lower limit of quantification，LLOQ）（3.12 μg·mL-1）血漿樣品+IS、患者血漿樣品+IS，按照“2.3”項下方法處理樣品，進樣分析，記錄色譜圖（圖1）。人血漿中替考拉寧和IS的保留時間分別為8.7 min和11.0 min，并且與前后峰分離度良好，血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)對測定無干擾，結(jié)果顯示本測定方法專屬性良好。

圖1 替考拉寧色譜圖A-空白血漿，B-空白血漿+內(nèi)標(biāo)溶液，C-空白血漿+替考拉寧最低定量下限（3.12 μg·mL-1），D-患者血漿樣品+內(nèi)標(biāo)溶液；1-替考拉寧，2-哌拉西林鈉Fig 1 The HPLC chromatogram of teicoplaninA-blank plasma, B-blank plasma + internal standard (IS), C -blank plasma + LLOQ (3.12 μg·mL-1), D-patient plasma sample +IS; 1-teicoplanin, 2-piperacillin sodium

2.4.2 殘留效應(yīng)的考察 最高濃度樣品制備：將“2.3”項下50 μL最高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液（100.00 μg·mL-1）加入到500 μL不同來源空白混合血漿中，按照“2.3”項下方法處理樣品，按照注射高濃度樣品之后注射空白樣品來估計殘留，空白和最高濃度樣本均進行6次樣本測定。結(jié)果表明，高濃度樣品之后在空白樣品中的殘留不超過定量下限的20%，并且不超過內(nèi)標(biāo)的5%，符合指導(dǎo)原則要求。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性考察 精密吸取“2.2.1”項下替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，加入空白血漿950 μL配制成濃度為100.00 μg·mL-1的樣品A。取空白血漿依次等比例稀釋，配制成濃度分別為50.00、25.00、12.50、6.25、3.12 μg·mL-1的樣品B、C、D、E、F。按“2.3”項下方法處理血漿，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各組分的峰面積。以替考拉寧濃度（X）對替考拉寧主峰組分TA2-2面積（Y）作圖，采用最小二乘法進行線性回歸。結(jié)果顯示，替考拉寧在3.12～100.00 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)與替考拉寧峰組分TA2-2面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為第一天：Y= 0.038X+ 0.013 5，R2= 0.999 2；第二天：Y= 0.040X+ 0.006 6，R2= 0.999 5；第三天：Y=0.039X+ 0.005 56，R2= 0.999 9，標(biāo)準(zhǔn)曲線的各質(zhì)量濃度值與其理論值的偏差都在±15%以內(nèi)。

2.4.4 批內(nèi)、批間精密度與準(zhǔn)確度的考察 按“2.2.4”項下方法配制成質(zhì)量濃度分別為33.33、11.11、3.70、3.12 μg·mL-1的質(zhì)控樣本，按照“2.3”項下方法處理樣品，每個濃度取5個樣本進行分析，連續(xù)測定3 d，按當(dāng)日的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算濃度，并根據(jù)質(zhì)控樣本的濃度計算批內(nèi)和批間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間RE分別為為- 7.19%～7.00%和- 4.70%～ 3.99%，批內(nèi)和批間RSD分別為0.76%～8.54%和2.36%～4.48%，表明本方法準(zhǔn)確度、精密度良好。相對偏差（RE）=（測量值-理論值）/理論值×100%。準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果見表1、表2。

2.4.5 穩(wěn)定性考察 血漿樣本穩(wěn)定性考察：將“2.3”項下的低、高濃度質(zhì)控溶液加入到500 μL混合空白血漿中，分別制備成低、高濃度質(zhì)控樣品（3.70 μg·mL-1、33.33 μg·mL-1）各5份，分別考察不同條件下替考拉寧的穩(wěn)定性：血漿經(jīng)過- 20 ℃冰箱到室溫的3次凍融后，按照“2.4”項下方法處理樣品，得到凍融穩(wěn)定性樣本；將血漿樣本按如下條件儲存：①放置于- 40 ℃冰箱放置21 d；②4 ℃下放置6 d，再于室溫放置24 h，按照“2.4”項下方法處理樣品，得到長期穩(wěn)定性樣本。將低、高濃度質(zhì)控樣品（3.70 μg·mL-1、33.33 μg·mL-1）按照“2.4”項下方法處理后，按如下條件儲存：①4 ℃下放置24 h；②室溫放置24 h，得到進樣池穩(wěn)定性和室溫穩(wěn)定性樣本。結(jié)果顯示，所有測定值的RSD和RE均在15%范圍內(nèi)，表明替考拉寧儲備液和工作溶液、血漿樣品、以及處理后樣品在所示試驗條件下穩(wěn)定。

表1 人血漿中替考拉寧的批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度（內(nèi)標(biāo)法）Tab 1 Intra and inter-day precision and accuracy determination of teicoplanin quality controls in human plasma (internal standard method)

表2 人血漿中替考拉寧的批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度（外標(biāo)法）Tab 2 Intra and inter-day precision and accuracy determination of teicoplanin quality controls in human plasma (external standard method)

2.4.6 臨床應(yīng)用 在2018年11月- 2019年3月期間，共有9例患者均采用靜脈滴注方式給予注射用替考拉寧，在給予負荷劑量3～8次，維持劑量2～4次后，于患者下一次給藥前抽取靜脈血（EDTA抗凝管）。樣本3000 r·min-1離心10 min，取血漿400 μL，按“2.3”項下方法處理，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，測得替考拉寧血藥濃度，詳見表4。

本實驗測定的9例患者谷濃度差異顯著，僅有2例（編號1、7）在說明書中建議的有效濃度（10～20 μg·mL-1）范圍內(nèi)，其中有4例（序號5、6、8、9）患者谷濃度低于說明書中建議的有效濃度，3例（序號2、3、4）患者谷濃度大于20 μg·mL-1，高于治療濃度范圍。但是患者的耐受性良好，均未出現(xiàn)不良反應(yīng)。第1～3號患者，由于其腎功能受損（＜ 60 mL·min-1），替考拉寧經(jīng)腎臟的清除受到影響，應(yīng)用常規(guī)劑量（6 mg·kg-1）能夠滿足治療濃度需求，甚至需要適當(dāng)減少用藥劑量。而對于腎功能正常的患者可能需要增加給藥劑量才能達到治療濃度范圍。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

色譜柱選擇，分別使用Agilent（C18柱：150 mm×4.6 mm，5 μm）和kromasil（C18柱，150 mm×4.6 mm，5 μm）進行分析，結(jié)果顯示kromasil色譜柱對替考拉寧的保留較Agilent色譜柱強，分離效果較Agilent色譜柱好，故選用kromasil色譜柱分析。

在流動相的選擇上，水-乙腈系統(tǒng)可以獲得良好的峰型。水與乙腈的體積比為75∶25時，替考拉寧和內(nèi)標(biāo)的保留時間為8.7 min和11.0 min，總分析時間為13 min，且分離度＞ 1.5，滿足基線分析需要。向流動相中添加離子對試劑可以進一步改善峰型，實驗過程中嘗試了不同種類和濃度緩沖鹽，如甲酸銨、乙酸銨、磷酸二氫鉀。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水中加入0.01 mol·L-1KH2PO4時峰型最佳，故我們最終選擇向水中加入0.01 mol·L-1KH2PO4用于分析。

對于檢測波長的選擇，分別選擇215 nm和240 nm作為檢測波長，進行檢測，發(fā)現(xiàn)波長為215 nm時，血漿中的雜質(zhì)吸收較強，對替考拉寧的測定有干擾；而波長為240 nm時血漿中的雜質(zhì)吸收較弱，不影響樣品分析，且能夠滿足最低定量限的檢測要求，因此選擇240 nm作為檢測波長。

替考拉寧主要是由5個結(jié)構(gòu)相似的化合物組成，其中以TA2-2為主。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，僅測定TA2-2峰面積與測定TA2-2～TA2-5總峰面積相比無統(tǒng)計學(xué)差異，由于僅測定TA2-2峰面積方法定量時較為方便，因此采用TA2-2定量。

表3 替考拉寧的穩(wěn)定性試驗. n = 6Tab 3 Stability data of teicoplanin. n = 6

表4 患者血藥濃度測定結(jié)果Tab 4 The TDM results of teicoplanin in patients

3.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

本研究分別選擇哌拉西林鈉、對羥基苯甲酸甲酯、香草醛、苯巴比妥、拉莫三嗪作為內(nèi)標(biāo)，結(jié)果顯示除哌拉西林鈉之外的化合物出峰均較早，難以與血漿中的雜質(zhì)基線分離，故選擇哌拉西林鈉為內(nèi)標(biāo)。但是臨床中會存在同時使用哌拉西拉鈉和替考拉寧的情況，同樣的數(shù)據(jù)用外標(biāo)法進行方法學(xué)驗證（結(jié)果見表2），結(jié)果表明外標(biāo)法同樣滿足方法學(xué)要求。因此，對于合并使用哌拉西林及替考拉寧的情況，可以使用外標(biāo)法進行數(shù)據(jù)處理。

3.3 樣品前處理方法的選擇

替考拉寧的極性較大，在樣品處理方法上，本實驗先采用乙腈蛋白沉淀法后再采用不同有機溶劑液液萃取的方法，包括二氯甲烷、甲基叔丁基醚等，結(jié)果表明乙腈沉淀蛋白后，用二氯甲烷萃取樣品的分離度較甲基叔丁基醚好。因此本實驗選擇二氯甲烷作為液液萃取溶劑進行樣品處理。

3.4 TDM的臨床應(yīng)用

有文獻[4,13]報道替考拉寧血清谷濃度（Cmin） ＜ 10 μg·mL-1為未達到滿意的治療濃度， 10 μg·mL-1≤Cmin＜ 20 μg·mL-1為治療革蘭陽性菌感染（MRSA）的有效濃度，20 μg·mL-1≤ Cmin＜ 60 μg·mL-1為治療心內(nèi)膜炎、血流感染、肺炎等嚴(yán)重金葡菌感染的有效濃度，≥ 60 μg·mL-1為產(chǎn)生毒性的血藥濃度。

本文中測定的9例患者（其中病例1是血濾患者，病例2和病例6的BMI ＞ 30 kg·m-2,使用校正公式進行肌酐清除率計算）使用替考拉寧在4.40～8.70 mg·kg-1劑量范圍內(nèi)，但是血藥濃度差異較大。替考拉寧的半衰期較長，需要給予負荷劑量以快速到達穩(wěn)態(tài)血藥濃度，但是關(guān)于負荷劑量尚未定論。有研究[5,13-14]表明，負荷劑量過小難以達到有效的濃度范圍，而劑量過大又會帶來不良反應(yīng)，因此我們應(yīng)密切關(guān)注患者替考拉寧的血藥濃度，通過監(jiān)測其谷濃度及時調(diào)整用藥方案以實現(xiàn)患者的個體化給藥，既保證替考拉寧的臨床療效減少耐藥的產(chǎn)生，又減少不良反應(yīng)的發(fā)生率。

綜上，本研究所建立的方法分析濃度范圍為3.12 ～100.00 μg·mL-1且方法專屬性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好、分析時間短，能夠滿足臨床需求。在臨床工作中，為達到最佳治療效果，避免藥品不良反應(yīng)的發(fā)生，應(yīng)監(jiān)測患者替考拉寧的血藥濃度，并及時調(diào)整用藥方案。