羅 亭 景海霞 王 恒 段德鑒 李 敏

(十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)皮膚科，十堰 442000)

目前在臨床上皮膚真菌感染的發(fā)病率越來(lái)越高，天然免疫作為機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線，對(duì)于皮膚真菌感染具有重要作用。當(dāng)真菌感染機(jī)體時(shí)，天然免疫細(xì)胞上的模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別入侵的真菌，與真菌成分(如酵母多糖)病原相關(guān)分子模式(PAMPs)結(jié)合，釋放炎癥因子TNF-α、IL-6等，起到抗真菌感染的作用[1]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的PRRs主要有Toll樣受體(TLRs)、C型凝集素受體(CLRs)和Nod樣受體[2,3]。其中與真菌感染相關(guān)的PRRs主要有TLRs和CLRs，其中Dectin-1和TLR2關(guān)系最為密切[4-6]。

酵母多糖是釀酒酵母的細(xì)胞壁制劑，由β-葡聚糖、甘露聚糖和幾丁質(zhì)組成，富含真菌的細(xì)胞壁成分，能識(shí)別包括Dectin-1和TLR2在內(nèi)的多種配體，可用來(lái)模擬體外真菌感染，用于真菌的免疫學(xué)研究[7-9]。角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的主要結(jié)構(gòu)，具有免疫功能，還存在多種PRRs，可以識(shí)別PAMPs，啟動(dòng)固有免疫，分泌或表達(dá)細(xì)胞因子、抗菌肽等，在皮膚真菌感染的天然免疫機(jī)制中扮演著重要角色。因此本文擬選用HaCaT細(xì)胞(人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞，具有與角質(zhì)形成細(xì)胞相同的特點(diǎn))，用不同濃度的酵母多糖處理HaCaT細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中TLR2和Dectin-1的mRNA、蛋白的表達(dá)以及TNF-α、IL-6的濃度變化，對(duì)酵母多糖啟動(dòng)機(jī)體的天然免疫識(shí)別機(jī)制進(jìn)行研究,使構(gòu)建皮膚真菌感染的細(xì)胞模型成為可能，也為皮膚淺表真菌感染的天然免疫機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源 HaCaT細(xì)胞購(gòu)自上海美軒生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑 酵母多糖購(gòu)自Invivogen公司；熒光定量PCR相關(guān)試劑購(gòu)自ToYoBo公司；TLR2、Dectin-1、β-actin引物由天一輝遠(yuǎn)公司合成(見(jiàn)表1)；PE-Dectin-1抗體購(gòu)自Biolegend公司；PE-TLR2抗體、PE標(biāo)記的鼠IgG2a同型對(duì)照購(gòu)自eBioscience公司；IL-6、TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自達(dá)科為公司；濃縮型正常山羊血清、熒光標(biāo)記羊抗兔IgG、熒光標(biāo)記羊抗小鼠IgG購(gòu)自武漢博士德公司；DAPI購(gòu)自碧云天公司；Dectin-1一抗購(gòu)自NOVUS公司；TLR2一抗購(gòu)自Santa公司。

1.1.3主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo electron公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)SW-CJ-1FD)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司，型號(hào)Quant Studin 6),PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，型號(hào)EDC-810),流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，型號(hào)FACS Calibur)，激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(Olympus，日本)，凝膠成像儀(BioRad公司，USA)，自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo scientific，USA)。

1.2方法

1.2.1HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)及處理 復(fù)蘇凍存的HaCaT細(xì)胞，常規(guī)方法培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到70%-80%，消化收集HaCaT細(xì)胞，接種到6孔板上，1×105個(gè)/孔，細(xì)胞長(zhǎng)滿至約60%～70%孔底，分別進(jìn)行如下處理：①加入酵母多糖混懸液使培養(yǎng)孔內(nèi)酵母多糖終濃度分別為0、10、100 μg/ml(濃度設(shè)置參照文獻(xiàn)[8,9,10],37℃培養(yǎng)24 h，吸取上清，置于EP管中，在保存-20℃，然后收集3組處理過(guò)的細(xì)胞提取總RNA(按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)；②加入酵母多糖混懸液濃度同①，培養(yǎng)24 h，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；③加入100 μg/ml酵母多糖混懸液，制作HaCaT細(xì)胞爬片，作用24 h。以上實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.2TLR2和Dectin-1的qPCR檢測(cè) 采用TRIzol法提取各分組細(xì)胞的總RNA后，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，再以cDNA為模板，參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞中TLR2和Dectin-1 mRNA的表達(dá)水平，引物如表1。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA 2.2506 ng，Oligo(dT)18(10 μmol/L) 2 μl，dNTP(2.5 mmol/L)4 μl，5×Hiscript Buffer 4 μl, Hiscript Reverse Transcriptase 1 μl,Ribonuclease Inhibitor 0.5 μl,ddH2O (Rnase free)加至20 μl，反應(yīng)條件：25℃ 5 min，50℃ 15 min，85℃ 5 min，4℃ 10 min；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)反應(yīng)體系：cDNA (5倍稀釋)4 μl，上游引物(10 μmol/L)0.4 μl，下游引物(10 μmol/L)0.4 μl，SYBR Green Master Mix 10 μl,50×ROX Reference Dye 20.4 μl，H2O 4.8 μl,反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。繪制溶解曲線。

表1 PCR引物的序列以及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR2和Dectin-1 ①用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集HaCaT細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，去上清，加PBS重懸；②4℃條件下2 000 r/min離心2 min，含0.5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS清滌2遍；③流式小管分別添加相應(yīng)抗體，4℃避光孵育30 min；④4℃條件下2 000 r/min離心2 min，以含0.5% BSA的PBS清滌2遍；⑤以含0.5% BSA的PBS 0.5ml重懸后流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，檢測(cè)各組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)。

1.2.4免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TLR2和Dectin-1的表達(dá)部位 ①用預(yù)溫的PBS將已爬好的細(xì)胞玻片浸洗3次，3 min/次；②固定爬片15 min(4%的多聚甲醛)，PBS洗清玻片3次，3 min/次；③0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min;④用PBS浸洗玻片3次，3 min/次，吸干后，滴正常山羊血清，室溫封閉30 min；⑤吸掉玻片上的封閉液，滴加足量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過(guò)夜；⑥加熒光二抗：PBST浸洗爬片3次，3 min/次，吸干爬片上的液體后，滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1 h，PBST浸洗切片3次，每次3 min；⑦復(fù)染核：加DAPI在黑暗中孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST洗滌玻片4次，每次5 min，洗去DAPI；⑧將爬片上的液體吸干，用封片液密封，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.5ELISA檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá) 將收集的上清液稀釋10倍，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟操作，檢測(cè)TNF-α、IL-6的濃度變化。

2 結(jié)果

2.1酵母多糖對(duì)HaCaT細(xì)胞TLR2 mRNA和Dectin-1 mRNA表達(dá)的影響 各濃度酵母多糖在不同程度上影響HaCaT細(xì)胞TLR2 mRNA和Dectin-1 mRNA的表達(dá)，隨著酵母多糖濃度升高，TLR2 mRNA和Dectin-1 mRNA表達(dá)量升高，其中10 μg/ml組TLR2 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(t=12.62，P<0.01)，Dectin-1 mRNA表達(dá)亦顯著升高(t=8.223，P<0.01),比TLR2 mRNA的表達(dá)更明顯。100 μg/ml組TLR2 mRNA和Dectin-1 mRNA均較10 μg/ml組表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.609,P<0.05和t=3.069,P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度酵母多糖對(duì)HaCaT細(xì)胞的TLR2 mRNA和Dectin-1 mRNA表達(dá)的影響

2.2酵母多糖作用HaCaT細(xì)胞后對(duì)TLR2和Dectin-1蛋白表達(dá)的影響 經(jīng)過(guò)處理的HaCaT細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其表面的Dectin-1和TLR2 MFI表達(dá)隨著酵母多糖濃度升高逐漸升高，100 μg/ml組最為顯著，明顯高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=36.02,P<0.01和t=45.6，P<0.01)，見(jiàn)圖2，表2。

表2 酵母多糖對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)TLR2和Dectin-1蛋白MFI的影響

圖2 酵母多糖誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞后TLR2和Dectin-1蛋白的影響

2.3免疫熒光檢測(cè)酵母多糖作用HaCaT細(xì)胞后TLR2和Dectin-1蛋白的核內(nèi)轉(zhuǎn)移情況 根據(jù)采集的圖像發(fā)現(xiàn)TLR2和Dectin-1蛋白在對(duì)照組中均在胞質(zhì)表達(dá)，幾乎看不到胞核內(nèi)有熒光表達(dá)，但是在加入酵母多糖誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)TLR2和Dectin-1蛋白在胞質(zhì)和胞核內(nèi)均有表達(dá)，見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞中TLR2和Dectin-1的免疫熒光染色(×400)

2.4酵母多糖作用HaCaT細(xì)胞后炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá) 酵母多糖處理HaCaT細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6的表達(dá)量均增高，其中10 μg/ml組與對(duì)照組相比TNF-α、IL-6的濃度顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.05,P<0.01和t=58.95,P<0.01)，但與10 μg/ml組與100 μg/ml組相比TNF-α的濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10 μg/ml組和100 μg/ml組相比IL-6的濃度有差別，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.676,P<0.05)，與酵母多糖濃度呈正相關(guān)，見(jiàn)表3。

表3 不同濃度酵母多糖作用HaCaT細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6的濃度

3 討論

本文通過(guò)體外研究探討酵母多糖對(duì)HaCaT細(xì)胞Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響以及TNF-α、IL-6濃度的變化。發(fā)現(xiàn)酵母多糖作用于HaCaT細(xì)胞后具有上調(diào)Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)的作用，與對(duì)照組相比炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的濃度也增高，并且都與濃度呈正相關(guān)。說(shuō)明酵母多糖可識(shí)別HaCaT細(xì)胞的PRRs,激發(fā)天然免疫識(shí)別過(guò)程。

通過(guò)查閱以往的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Dillon等[8]將酵母多糖作用于巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)TLR2、Dectin-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平增高，還可激活下游的MyD88和Syk信號(hào)通路，最終導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子活性的增強(qiáng)并釋放大量的炎癥細(xì)胞因子TNF-α，放大炎癥反應(yīng)，共同參與酵母多糖的免疫識(shí)別過(guò)程。毛亞男等[10]用酵母多糖刺激小鼠巨噬細(xì)胞，在早期發(fā)現(xiàn)，酵母多糖可顯著上調(diào)受體Deetin-1、TLR2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子TNF-α的釋放，最終誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。Wu等[9]用酵母多糖處理永生化人角膜上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)酵母多糖可激活TLR2下游的一系列炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-8)和核轉(zhuǎn)錄因子κB的表達(dá)，使用TLR2阻斷劑后，上述炎癥因子的表達(dá)均降低。這些研究均表明酵母多糖可激活機(jī)體的天然免疫過(guò)程，可體外模擬皮膚真菌感染模型，與本研究具有一致性。但是Dillon的研究也表明，在用酵母多糖刺激樹(shù)突狀細(xì)胞后，炎癥因子IL-6的表達(dá)降低，甚至沒(méi)有表達(dá)，這一結(jié)果與本文不一致，我們推測(cè)可能與使用的細(xì)胞模型和實(shí)驗(yàn)條件不同有關(guān)。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，酵母多糖可致Dectin-1、TLR2蛋白的表達(dá)部位發(fā)生變化，對(duì)照組中其表達(dá)部位主要在胞質(zhì)，但是在經(jīng)過(guò)酵母多糖處理后發(fā)現(xiàn)Dectin-1、TLR2蛋白在胞質(zhì)和胞核中均有表達(dá)，其中蛋白TLR2胞核表達(dá)的現(xiàn)象較Dectin-1明顯。Reuven等[11]發(fā)現(xiàn)TLRs在胞外區(qū)識(shí)別PAMPs后，胞漿區(qū)的TIR結(jié)構(gòu)域激活并介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)激活MyD88，降解NF-κB抑制蛋白α，使得釋放NF-κB轉(zhuǎn)位入核，從而啟動(dòng)相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄[12,13]。我們推測(cè)可能是酵母多糖誘導(dǎo)了Dectin-1、TLR2蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的合成，也可能是在酵母多糖的作用下，Dectin-1和TLR2通過(guò)激活下游的Syk和MyD88信號(hào)通路，促進(jìn)了核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化，介導(dǎo)靶基因的核內(nèi)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，酵母多糖對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)Dectin-1、TLR2及炎癥因子TNF-α、IL-6有促進(jìn)的作用，可以啟動(dòng)機(jī)體的天然免疫，使皮膚真菌感染體外模型的構(gòu)建成為可能，也為我們以后皮膚淺表真菌感染的天然免疫機(jī)制研究提供一定的方便，并且對(duì)于抗真菌藥物的研究也打下基礎(chǔ)。但是本文在信號(hào)通路的研究上有一定的不足，酵母多糖具體通過(guò)何種機(jī)制調(diào)控TLR2和Dectin-1及TNF-α、IL-6，還有待進(jìn)一步論證，我們將在接下來(lái)的研究中進(jìn)行更加深入的探討。