麥明思 趙 焱 馬 鍇 (三亞市人民醫(yī)院口腔科，三亞 572000)

口腔鱗狀細胞癌指發(fā)病于口腔，以鱗狀細胞為主的惡性腫瘤，是頭頸部腫瘤中惡性程度最高且危害最大的腫瘤[1，2]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是引起患者病情惡化的重要因素，因此尋找抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的方法十分重要[3]。p21活化激酶2(p21 activated kinase 2,PAK2)屬于進化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是小G蛋白Rho家族中GTP的重要效應(yīng)物[4]。研究表明PAK2活性升高與人類腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如PAK2/PIX通路活化能誘導(dǎo)乳腺癌雌激素抵抗[5]。PAK2活化與晚期胃癌的進展及預(yù)后不良相關(guān)[6]?？谇击[狀細胞癌相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，相比于正?？谇火つそM織，PAK2在口腔鱗癌中表達顯著增強[7]。miR-411經(jīng)研究證實在腎細胞癌、乳腺癌、大腸癌等多種腫瘤中均發(fā)揮抑癌因子作用[8-10]。但其在口腔鱗癌中的作用尚未闡明。Wnt通路經(jīng)研究證實在包括口腔癌在內(nèi)的頭頸部腫瘤中均存在異常活化現(xiàn)象。本研究旨在探討miR-411-3p靶向PAK2在口腔鱗狀細胞癌中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器 基因組DNA提取試劑盒、Lipofectamine 3000試劑盒、Trizol試劑盒、TransScriptⅡGreen One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒、CCK8試劑盒購自賽默飛世爾；人舌鱗癌細胞株HSC-4、Tca8113、TcaSll3及人頰鱗癌細胞株BcaCD885購自拜力生物；miR-411-3p agomir、miR-411-3p antagomir購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；DAB染液、蘇木素染液、伊紅染液購自北京索萊寶；所有抗體購自ABCAM；Transwell小室購自北京明陽科華生物科技有限公司；Anexin-V-FITC染液、PI染液購自上海碧云天；流式細胞儀購自德國貝克曼；倒置顯微鏡購自奧林巴斯；實時熒光定量PCR儀購自賽默飛世爾；PCR引物序列由華大基因合成。

1.1.2組織來源 收集我院2017年5月至2018年10月通過外科手術(shù)切除的口腔鱗癌組織52例，術(shù)前均未進行放化療及免疫治療，其中男性38例，女性14例，年齡22～72歲，平均年齡 (42.2±7.3) 歲。其中高分化鱗癌28例，中分化鱗癌13例，低分化鱗癌11例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例。以52例正常的口腔黏膜上皮組織作為對照，其中男性31例，女性21例，年齡24～68歲，平均年齡(40.3±6.9)歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會審批且所有患者知情同意。

1.2方法

1.2.1免疫組化檢測 將癌組織及正常黏膜上皮組織以石蠟包埋后切片。60℃溫箱烤干，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，雙氧水和蒸餾水洗滌，微波抗原修復(fù)。切片冷卻后PBS沖洗，5% BSA室溫封閉，加入一抗兔抗小鼠PAK2孵育1 h，加入二抗山羊抗兔IgG孵育20 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗。梯度酒精脫水，中性樹膠封固。倒置顯微鏡觀察組織染色情況。Image J軟件統(tǒng)計癌組織及正常黏膜組織的PAK2陽性表達率。

1.2.2PAK2沉默重組質(zhì)粒構(gòu)建 UCSC獲取人PAK2編碼區(qū)序列(NM_002577)，BLOCK-iTTMRNAi Designer網(wǎng)站在線設(shè)計PAK2的shRNA序列(5′-CACCGTCTGATAACGGAGAACTGGACGAATCCAGTT-CTCCGTTATCAGAC-3′)。在shRNA序列兩端加上EcoRⅠ 和BamHⅠ 酶切位點。T4DNA連接酶將酶切后的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒線性化載體與目的基因片段連接并過夜，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌克隆。酶切電泳鑒定后提取大腸桿菌中重組載體，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3細胞分組及轉(zhuǎn)染 人舌鱗癌細胞株HSC-4、Tca8113、TcaSll3及人頰鱗癌細胞株BcaCD885培養(yǎng)于含10%FBS及1%P/S的MEM培養(yǎng)基中，Western blot篩選PAK2蛋白表達最高的細胞系用于后續(xù)實驗并分為：陰性對照組(轉(zhuǎn)染含有無關(guān)序列的重組質(zhì)粒)、miR-411-3p agomir組(轉(zhuǎn)染miR-411-3p agomir)、miR-411-3p antagomir組(轉(zhuǎn)染miR-411-3p antagomir)、基因沉默組(轉(zhuǎn)染含有PAK2 shRNA的重組質(zhì)粒)及聯(lián)合組(miR-411-3p agomir聯(lián)合PAK2沉默處理細胞)。

傳代后取對數(shù)期細胞，待細胞生長至70%～90%融合度進行轉(zhuǎn)染，Opti-MEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至3×105個/ml并接種于24孔板。將50 μl Opti-MEM分別與1.5 μl Lipofectamine 3000及1 μg PAK2 shRNA重組質(zhì)粒(濃度為2 μg/μl)混勻，以1∶1 充分混勻并于室溫孵育5 min。將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加至含有口腔鱗癌細胞的24孔板，輕柔搖晃，培養(yǎng)24～48 h后更換培養(yǎng)基。miR-411 agomir、miR-411 antagomir及陰性對照的轉(zhuǎn)染方式同上。

1.2.4qRT-PCR檢測 按Trizol試劑說明書提取口腔鱗癌細胞系總RNA。DEPC處理的超純水溶解RNA，TransScriptⅡGreen One-Step qRT-PCR Super Mix試劑盒一步完成RT-PCR合成及PCR。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均依據(jù)試劑盒說明書操作。實時熒光定量PCR儀進行擴增，miR-411-3p以U6為內(nèi)參，其他檢測因子以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。2-ΔΔCt法計算相對表達量。

表1 qRT-PCR引物

1.2.5Western blot檢測蛋白表達 棄細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌，RIPA裂解液裂解細胞，勻漿，離心后去上清，去離子水調(diào)整蛋白濃度，行SDS-PAGE凝膠電泳并將細胞轉(zhuǎn)至PVDF膜。加入含5% BSA的TBST，室溫封閉1 h。加入一抗兔抗鼠Wnt1、GSK3β、β-catenin、E-cadherin、N-cadherin抗體，4℃過夜。加入二抗山羊抗兔IgG，4℃孵育，取化學(xué)發(fā)光試劑A液與B液按1∶1混勻后，均勻滴加至NC膜，顯影液顯影。分析條帶光密度，蛋白質(zhì)相對表達量為目標條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值。

1.2.6CCK8測定細胞活力 將細胞懸液(約1×105個)加入96孔板，設(shè)置陰性對照，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜。加入CCK8溶液，檢測0、24、48 h吸光度(450 nm)。

1.2.7細胞劃痕實驗 實驗前用marker筆對12孔板做背面標記，0.25%胰酶消化細胞，將細胞接種于12孔板。待細胞鋪滿板底后，1 ml槍頭垂直于孔板劃痕。去除細胞培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入無血清MEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱，48 h后拍照并統(tǒng)計細胞遷移率。

1.2.8Transwell細胞侵襲實驗 按1∶10比例采用MEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠，后將100 μl Matrigel膠加入上室。DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整至3×105個/ml，取100 μl細胞加入上室，下室加入600 μl 含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，依據(jù)Transwell說明書進行結(jié)晶紫染色。染色結(jié)束后于光鏡下選取3個視野對跨膜細胞進行計數(shù)，計算侵襲細胞數(shù)目。

1.2.9Annexin V-FITC/PI雙染檢測口腔鱗癌細胞凋亡 取轉(zhuǎn)染后細胞，PBS沖洗，離心后棄上清，調(diào)整細胞濃度為4×105個/ml，加入500 μl結(jié)合緩沖液，加入5 μl Anexin-V-FITC及5 μl PI染液混勻，避光孵育10 min。流式細胞儀檢測凋亡情況，激發(fā)波長488 nm，530 nm處檢測FITC，575 nm檢測PI，統(tǒng)計細胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1miR-411-3p與PAK2存在靶向結(jié)合關(guān)系 與NC組相比，PAK2野生型3′UTR熒光素酶活性被miR-411-3p顯著抑制，而突變型3′UTR熒光素酶活性未被抑制。說明miR-411-3p可靶向抑制PAK2基因表達(圖1)。

圖1 miR-411-3p與PAK2靶向調(diào)控關(guān)系驗證

2.2正常組織口腔鱗癌組織中miR-411-3p、PAK2表達 PAK2蛋白在胞漿和核內(nèi)表達存在差異(圖2)。與癌旁組織[(15.34±1.71)%]相比，癌組織中PAK2細胞陽性率[(73.12±6.29)%]上調(diào)。與正?？谇火つど掀そM織相比，癌組織miR-411-3p表達顯著下降，PAK2表達顯著上升(P<0.05)。

圖2 各組miR-411-3p及PAK2表達情況

2.3過表達miR-411-3p或沉默PAK2對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 qRT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-411-3p過表達或沉默PAK2可抑制Wnt信號通路相關(guān)因子(Wnt1,β-catenin)及N-cadherin表達，促進E-cadherin及GSK3β表達，且聯(lián)合組效果更為顯著(P<0.05)，抑制miR-411-3p表達則效果相反，見圖3。

圖3 過表達miR-411-3p或沉默PAK2對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

2.4各組細胞活力檢測結(jié)果 CCK8檢測各組細胞生長活力情況顯示，與陰性對照組相比，上調(diào)miR-411-3p表達或抑制PAK2表達可抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的生長活力且聯(lián)合處理效果更為顯著(P<0.05)。抑制miR-411-3p表達可顯著提高口腔鱗狀細胞癌細胞活力(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組細胞活力檢測結(jié)果

2.5各組細胞劃痕愈合情況檢測 與陰性對照組相比，miR-411-3p agomir組及PAK2 shRNA組劃痕愈合率顯著下降，且聯(lián)合組效果更為明顯(P<0.05)，miR-411-3p antagomir組細胞劃痕愈合率顯著上升(P<0.05)，見圖5。

圖5 各組細胞劃痕檢測結(jié)果

2.6各組細胞侵襲情況檢測結(jié)果 與陰性對照組相比，miR-411-3p agomir組及PAK2 shRNA組細胞侵襲明顯減少，且聯(lián)合組效果更顯著(P<0.05)，miR-411-3p antagomir組細胞侵襲為顯著增加(P<0.05)，見圖6。

圖6 各組細胞Transwell檢測結(jié)果

2.7各組細胞凋亡情況檢測結(jié)果 與陰性對照組相比，miR-411-3p agomir組及PAK2 shRNA組細胞凋亡明顯著增加，且聯(lián)合組效果更為明顯(P<0.05)，miR-411-3p antagomir組細胞凋亡顯著減少(P<0.05)，見圖7。

圖7 各組細胞凋亡情況

3 討論

口腔鱗狀細胞癌是指不同程度鱗狀分化、合并上皮侵襲性的腫瘤，也是口腔惡性腫瘤中最為常見的類型[11]。盡管近年來針對該病的治療取得了一定進展，但患者的5年生存率仍然較低，尤其是晚期合并遠處轉(zhuǎn)移的患者，常規(guī)手術(shù)、放化療等治療方式效果均不理想[12]。本研究從基因靶向治療的角度出發(fā)，探討miR-411-3p對口腔鱗癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其作用機制，發(fā)現(xiàn)miR-411-3p可靶向PAK2基因介導(dǎo)Wnt信號通路進而調(diào)控口腔鱗癌細胞的生物學(xué)特性。

研究證實PAK2活性在多種腫瘤細胞中顯著升高，且PAK2高表達與腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)。Zhang等[5]預(yù)后研究發(fā)現(xiàn)PAK2高表達與藥物治療管腔性乳腺癌不良相關(guān)。抑制PAK2表達可抑制皮膚黑色素瘤細胞增殖[13]。下調(diào)PAK2表達可抑制卵巢癌細胞系遷移和侵襲能力[14]。關(guān)于口腔鱗癌的研究也證實PAK2在口腔鱗癌組織中表達顯著上升且與腫瘤分級相關(guān)[7]。本研究通過免疫組化、qRT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，相對于正?？谇火つそM織，癌組織中PAK2表達顯著上升，與既往研究結(jié)論一致。本研究證實miR-411-3p是PAK2的靶向miRNA，在口腔鱗癌中表達顯著下降。既往研究證實miR-411在多種癌癥中均發(fā)揮抑癌因子作用。Bai等[15]在關(guān)于胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-411能夠抑制胃癌細胞增殖和遷移。miR-411能夠延緩膀胱癌進展[16,17]。miR-411在卵巢癌和宮頸癌中可抑制腫瘤細胞增殖，延緩癌癥進展[18,19]。

本研究在前人研究的基礎(chǔ)上進一步發(fā)現(xiàn)miR-411-3p在口腔鱗癌細胞中同樣發(fā)揮抑癌因子作用，通過抑制PAK2基因及激活Wnt信號通路發(fā)揮作用。Wnt信號通路的異常激活是腫瘤發(fā)生的重要因素，β-catenin大量積聚是引發(fā)Wnt通路激活及腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵原因[20]。糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)在Wnt通路中起調(diào)控開關(guān)作用，能夠促進β-catenin磷酸化及轉(zhuǎn)錄過程調(diào)控[21]。研究證實口腔鱗癌中GSK-3β失活，在口腔鱗癌、鼻咽癌等惡性腫瘤中均發(fā)揮抑癌因子作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于陰性對照組，激活miR-411-3p或沉默PAK2表達可促進GSK3β表達，抑制Wnt通路激活，延緩口腔鱗癌進展。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在惡性腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用備受關(guān)注。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化主要表現(xiàn)為間質(zhì)表型神經(jīng)性鈣黏蛋白N-cadherin表達上升及上皮表型鈣黏蛋白E-cadherin丟失，在包括口腔癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達降低、N-cadherin表達增高[23]。本研究發(fā)現(xiàn)激活miR-411-3p或沉默PAK2后E-cadherin表達上調(diào)，N-cadherin表達降低，表明過表達miR-411-3p或沉默PAK2可減少口腔鱗癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。進一步通過MTT、劃痕愈合實驗、Transwell實驗等對各組細胞的增殖活性、遷移和侵襲能力進行檢測發(fā)現(xiàn)，抑制miR-411-3p能夠顯著增強細胞活力及遷移和侵襲能力，而激活miR-411-3p或沉默PAK2表達則能夠顯著抑制細胞活力，減少癌細胞遷移和侵襲。流式細胞術(shù)進一步證實過表達miR-411-3p及沉默PAK2在促進癌細胞凋亡中的重要價值。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-411-3p能夠靶向抑制PAK2表達，通過影響Wnt信號通路的活性調(diào)控口腔鱗狀細胞癌的生物學(xué)特性進行調(diào)控。過表達miR-411-3p能夠顯著抑制口腔鱗癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進癌細胞凋亡，miR-411-3p有望成為口腔鱗狀細胞癌靶向治療的重要分子靶點。