陳芳，張悅，唐靜，李俊杰

(重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067)

花色苷是一類廣泛存在于果蔬花草等高等植物中的化合物，一些發(fā)達國家已將其開發(fā)為藥品和保健食品[1]。紫薯花色苷是從紫薯中提取出的一種花色苷，具有降血壓、降血脂、抗氧化、防突變、抗腫瘤、保護肝臟和預(yù)防心血管疾病等功效[2]。但由于其母核連有許多羥基，易受環(huán)境中氧、熱、pH、光等影響導(dǎo)致分子異構(gòu)、聚合和降解，從而導(dǎo)致天然花色苷易降解褪色[3]。因此，如何提高花色苷的穩(wěn)定性，提高人體吸收率，一直備受關(guān)注。

為了提高紫薯花色苷的生物利用率，本實驗制備了海藻酸鈉與果膠的天然復(fù)合鈣凝膠珠，去包埋紫薯花色苷，并分析果膠與海藻酸鈉的濃度比例、氯化鈣溶液濃度、交聯(lián)時間對凝膠珠質(zhì)地、對紫薯花色苷的包埋率的影響。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

橘皮果膠(APC230，酯化度35)，由煙臺安德利果膠有限公司提供；紫薯花色苷(純度10%)，由陜西森朗生物化工有限公司提供；海藻酸鈉(食用級)，由青島明月海藻集團有限公司提供；氯化鈣(食品級)，由浙江一諾生物科技有限公司提供；氯化鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氫氧化鈉、鹽酸、甲醇、乙醇等均為分析純。

TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀；UV1102Ⅱ型紫外可見分光光度計；900-CN pH計；T09-1S恒溫磁力攪拌器；HJ-6A多頭磁力攪拌器；ZWY-110X30型恒溫培養(yǎng)振蕩箱；LGJ-18S型冷凍干燥機；XKA-2200臺式低速離心機；SU8020掃描電子顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫薯花色苷橘皮果膠鈣凝膠球的制備 按照一定比例分別稱取相應(yīng)質(zhì)量的樣品，溶于30 mL蒸餾水中，并在恒溫磁力攪拌器上攪拌30 min(1 000 r/min、20 ℃)，將混合均勻的溶液離心(4 000 r/min、10 min)，以去除溶液表面氣泡，然后移入注射器(20 mL)中，備用。將膠體溶液室溫滴入不同濃度的氯化鈣溶液中攪拌，移出在去離子水中攪拌4 min以清洗凝膠珠，于室溫下培養(yǎng)皿中保存。

1.2.2 單因素實驗 在果膠1.5 g，白砂糖2.7 g，紫薯花色苷0.075 g，去離子水30 mL時，選取變量膠凝時間(1，2，3，4，5 min)、果膠與海藻酸鈉比例(4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1)、氯化鈣溶液濃度(1%，3%，6%，9%，12%)3個可能影響凝膠珠質(zhì)構(gòu)和包封率的因素，按照1.2.1節(jié)方法進行單因素實驗以確定各單因素的適宜范圍。

1.2.3 果膠鈣凝膠球制備條件優(yōu)化 采用正交實驗，對果膠鈣凝膠球制備條件進行優(yōu)化，其因素和水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 質(zhì)構(gòu)分析 使用質(zhì)構(gòu)儀對凝膠珠進行TPA質(zhì)地測定，采用直徑35 mm圓柱形探頭P36R，測試條件確定如下：預(yù)測試速度1.0 mm/s，測試速度和測后速度均為0.5 mm/s，目標模式是strain，凝膠珠的壓縮量為30%，使用觸發(fā)力為0.05 N的Auto(Force)觸發(fā)型，皮重模式為Auto。每項測試重復(fù)3次，取硬度和彈性數(shù)據(jù)進行極差分析，選取最優(yōu)組。

1.2.5 紫薯花色苷橘皮果膠鈣凝膠球載藥量及包封率的測定

1.2.5.1 制作標準曲線 精密稱取0.1 g樣品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，制成 1 mg/mL 溶液。然后分別取出2，4，6，8，10 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液定容至10 mL。利用紫外分光光度計，在527 nm下測量5種不同濃度(0.2，0.4，0.6，0.8，1 mg/mL)溶液的吸光度值，并以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪成曲線。

圖1 紫薯花色苷標準濃度曲線Fig.1 The calibration curve of purple sweet potato anthocyanin

由圖1可知，紫薯花色苷的標準曲線回歸方程為：y=0.743x-0.073(r=0.996)，由標準曲線可知，紫薯花色苷濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.2.5.2 樣品中紫薯花色苷的測定 從烘箱中取出干燥后的樣品，用研缽做粗略粉碎后稱取1 g樣品于100 mL錐形瓶中。用移液管移取25 mL甲醇于錐形瓶。之后用分散儀進行進一步粉碎，直至小顆粒變?yōu)榧毼⒌姆勰㈠F形瓶瓶口用橡膠塞密封，防止甲醇揮發(fā)。將錐形瓶放置在陰涼避光的場所提取24 h。將提取液于4 000 rad/min下離心 10 min。移取上清液于比色皿中。以甲醇為空白對照，將紫色分光光度計波長設(shè)置為527 nm，測定樣品溶液對應(yīng)吸光度值[4]。

1.2.6 溶脹性能研究 干燥的凝膠珠溶脹性通過在緩沖液中進行實驗。具體方法為：精密稱取干燥后的凝膠珠，分別放在裝有25 mL緩沖溶液(pH分別為：4.0，7.0，9.0)的帶蓋培養(yǎng)皿中，25 ℃恒溫水浴，然后間接性的(每過1 h)將凝膠珠取出并且用濾紙吸干其表面的水分并在電子天平上稱重[5]。溶脹系數(shù)通過以下公式計算：

ESR=(WEs-Wd)/Wd

溶脹比為：SR= (WS-Wd)/Wd

其中，ESR為平衡溶脹比；WEs為水凝膠達到平衡溶脹時的質(zhì)量；SR為溶脹比；WS為水凝膠不同時間段的溶脹質(zhì)量；Wd為凝膠珠干燥質(zhì)量。

1.2.7 體外緩釋 模擬胃液：KCl(1.12 g/L)，NaCl(2.0 g/L)，CaCl2(0.11 g/L)，KH2PO4(0.4 g/L)，用鹽酸將 pH 調(diào)整為
1.2。模擬腸液就用碳酸氫鈉將上述溶液pH調(diào)整至6.8。模擬結(jié)腸液就在腸液中用碳酸氫鈉將pH調(diào)為7.4并加入果膠酶。取新鮮制備的凝膠珠，加入到100 mL裝有模擬胃液的錐形瓶中，錐形瓶放置在恒溫振蕩箱中(150 r/min，37 ℃)2 h，其中每隔30 min用紫外分光光度計檢查紫薯花色苷的含量。然后重新收集凝膠珠轉(zhuǎn)移到模擬腸液中，每隔 30 min 檢測溶液中紫薯花色苷的含量。直到2 h 后，轉(zhuǎn)移至模擬結(jié)腸液中，每隔 30 min檢測紫薯花色苷的含量[6]。

1.2.8 掃描電鏡 利用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察凝膠球的表面形貌。將冷凍干燥的樣品粘到導(dǎo)電膠上，在真空下噴金，加速電壓設(shè)置為10.0 kV，分別在35倍和100倍下對凝膠球的整體形態(tài)結(jié)構(gòu)和剖面形態(tài)進行觀察。剖面的制作是將樣品放置于液氮中，用刀子切面即可。

2 結(jié)果與討論

2.1 果膠與海藻酸鈉質(zhì)量比對凝膠珠機械性能的影響

微膠囊的功能性與其化學(xué)與機械穩(wěn)定性密切相關(guān)。若微球容易變形，則微膠囊就比較容易受到破壞造成包容物被提前釋放。不同果膠與海藻酸鈉質(zhì)量比對凝膠珠機械性能的影響見表2。

表2 果膠與海藻酸鈉質(zhì)量比對凝膠珠機械性能的影響Table 2 Effect of mass ratio of pectin/alginate on the mechanical properties of gel beads

由表2可知，隨著果膠與海藻酸鈉質(zhì)量比的增大，凝膠珠的硬度呈現(xiàn)增大的趨勢，而彈性卻無顯著性變化。這是因為海藻酸鈉的黏性比果膠大，因此當凝膠珠中海藻酸鈉較大時，凝膠珠間粘性變大，硬度降低，而隨著果膠與海藻酸鈉的質(zhì)量比例增大至7∶1時，凝膠珠的黏性減小，脆性和硬度增大。梁嬌旸之前的研究也顯示相同體積分數(shù)的海藻酸鈉溶液黏度較果膠溶液黏度要大[7]。Bekhit的研究顯示，海藻酸鈉與果膠的復(fù)合物比單純的果膠和海藻酸鈉更能增強凝膠珠的機械性能，凝膠珠更硬，這是由于果膠和海藻酸鈉的協(xié)同效應(yīng)導(dǎo)致，另外從分子建模來看，海藻酸鈉的G區(qū)域和甲氧基化的半乳糖醛酸帶可在平行的雙晶陣列中相互組合[8]。另外，由表可知，包封率隨著果膠的增加而增加，但隨著海藻酸鈉的比例減少，凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得稀疏，當果膠與海藻酸鈉的比例為8∶1時，包封率達到最大，而后開始減少。

2.2 氯化鈣濃度對凝膠珠機械性能的影響

氯化鈣濃度對凝膠珠機械性能的影響見表3。

表3 氯化鈣濃度對凝膠珠機械性能的影響Table 3 Effects of calcium chloride concentration on mechanical properties of gel beads

由表3可知，隨著氯化鈣濃度的增大，凝膠珠的硬度不斷增大，彈性則逐漸減小至最低然后保持不變。這是因為，隨著氯化鈣濃度的增大，有利于果膠與海藻酸之間的交聯(lián)，使凝膠網(wǎng)絡(luò)形成更致密，導(dǎo)致凝膠珠硬度增大。但隨著氯化鈣的濃度繼續(xù)增大，過量的Ca2+則導(dǎo)致果膠與海藻酸鈉聚集形成沉淀，或成為不溶性的鹽類物質(zhì)，并產(chǎn)生苦味，導(dǎo)致凝膠珠的口感質(zhì)地變差。此結(jié)果與孔靜等的研究一致[9]。另外，凝膠球的包封率隨著氯化鈣濃度的增加呈現(xiàn)增大的趨勢，這可能由于，隨著氯化鈣的濃度的增大，交聯(lián)充分，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密，使得更多的紫薯花色苷被緊緊固定在凝膠球內(nèi)，這與劉敏的研究結(jié)果相似[10]。

2.3 膠凝時間對凝膠珠機械性能的影響

膠凝時間對凝膠珠機械性能的影響見表4。

表4 膠凝時間對凝膠珠機械性能的影響Table 4 Effect of gelation time on mechanical properties of gel beads

由表4可知，隨著膠凝時間的增加，凝膠珠的硬度呈現(xiàn)增大的趨勢，彈性則顯著性降低，這是因為，由于時間的增大，使得果膠、海藻酸鈉與鈣離子之間進行充分的交聯(lián)，使得凝膠珠變得更加的致密，從而導(dǎo)致凝膠珠的硬度增大，而彈性降低，由表4還可知，當膠凝時間從4 min增大到5 min時凝膠珠的硬度出現(xiàn)明顯的增大趨勢，而彈性無顯著性變化。

2.4 果膠鈣凝膠球制備條件的優(yōu)化

根據(jù)以上單因素實驗，選取果膠與海藻酸鈉質(zhì)量比、氯化鈣濃度與凝膠珠膠凝時間，以形成的凝膠珠的硬度、彈性、對紫薯花色苷的包封率為指標進行正交實驗，來確定制備凝膠珠的最優(yōu)條件，正交實驗結(jié)果見表5。

表5 正交實驗結(jié)果Table 5 Result of orthogonal experiment

由表5可知，對紫薯花色苷包埋率最大的為第6組，機械性能較好的也為第6組實驗制備的凝膠珠，這也與之前的單因素實驗結(jié)果基本一致。彈性最大組為第1組，但此時硬度過低，果膠凝膠珠容易變形易破裂。由表5還可知，各因素中對凝膠珠硬度影響最大的為果膠與海藻酸鈉質(zhì)量比，對彈性和包封率兩個指標影響最大為氯化鈣濃度。由正交實驗結(jié)果還可得出，當硬度和包封率最佳時的水平組合為果膠/海藻酸鈉質(zhì)量比為7∶1，氯化鈣濃度為9%，膠凝時間為5 min。由pearson函數(shù)分析，正交實驗結(jié)果的硬度和包封率相關(guān)系數(shù)為0.70為強正相關(guān)。即硬度越大，對紫薯花色苷的包封率就越大，由彈性數(shù)據(jù)可知，除了第1組、第8組彈性值明顯高于其他組外，其他組的彈性并無顯著性差異。以正交最佳水平做驗證實驗，得出凝膠珠包封率為
1.10 mg/mL，遠高于最高的第6組(7∶1、5 min、3%)，因為最優(yōu)組氯化鈣濃度高于第6組，所測結(jié)果符合單因素實驗所得規(guī)律。

2.5 溶脹性能實驗

凝膠球的溶脹性能是應(yīng)用于食品、藥品等領(lǐng)域時需要衡量的重要因素之一。溶液環(huán)境會大大影響凝膠球的溶脹性能。本實驗考察了凝膠球在不同pH溶液介質(zhì)中的溶脹情況，結(jié)果見圖2。

圖2 不同介質(zhì)中凝膠球的溶脹率Fig.2 The swelling ratio of beads in different mediums

由圖2可知，凝膠球在溶液中溶脹前后直徑均有明顯變化，其中，在酸性和中性溶液中的溶脹比大致相同，在堿性溶液中的溶脹比大于在酸性和中性溶液中的溶脹比。在酸性和中性溶液中溶脹后的凝膠球還保持有一定彈性和硬度，在堿性溶液中的凝膠球溶脹后出現(xiàn)破碎脫落現(xiàn)象。這可能是因為在酸性溶液中帶電荷的羧基數(shù)量較少，分子間斥力較低，而在堿性溶液中大量羧基基團被離子化，形成 —COO-，這些陰離子間產(chǎn)生靜電排斥力，大量水分子進入凝膠體系中，使得凝膠球溶脹比增大，且果膠在堿性溶液中會發(fā)生皂化反應(yīng)而被脫脂化[5，11-12]，從而產(chǎn)生破碎脫落現(xiàn)象。

2.6 體外緩釋實驗

就紫薯花色苷從凝膠球中的釋放，本文模擬了胃腸道進行釋放研究，結(jié)果見圖3。

圖3 凝膠球在模擬體外緩釋中紫薯花色苷的累積釋放率Fig.3 Cumulative release rate of anthocyanins from purple potato in simulated slow release in vitro

由圖3可知，紫薯花色苷在胃液中累積釋放量為25.02%，在腸液中累積釋放量達到34.5%，在結(jié)腸液中大量釋放，累積釋放量為54.8%，由于模擬時間有限，可以看出凝膠球在5 h時，還未完全降解。在模擬胃液中，由于凝膠球具有多孔結(jié)構(gòu)，凝膠球此時溶脹較弱也有部分紫薯花色苷釋放出來，而在腸液和結(jié)腸液中，由于凝膠球的進一步溶脹和果膠酶的存在更加速了紫薯花色苷的釋放[13]。實驗結(jié)果表明，制備的海藻酸鈉與果膠的天然復(fù)合鈣凝膠珠能將紫薯花色苷定向輸送至腸道，從而提高了人體對其吸收利用率。

2.7 凝膠球表面和超微結(jié)構(gòu)比較

肉眼觀察濕態(tài)凝膠球，其直徑在0.5～0.7 cm，表面光滑，呈紫紅色半透明狀態(tài)。烘干后凝膠球為扁平的橢圓球狀，表面光滑，呈深紅色。凍干后的凝膠球為橢圓球狀，表面有皺縮，呈紅色。

掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果見圖4。

圖4 凝膠球在不同狀態(tài)下的表征形態(tài)Fig.4 Characterization of gel spheres in different states A.濕態(tài)凝膠球；B.凍干凝膠球表面(100×)；C.凍干凝膠球切面(35×)

由圖4可知，凍干后，凝膠球體積發(fā)生明顯變化，表面粗糙并產(chǎn)生褶皺，整體為橢球形。半球切面顯示，凝膠球外殼結(jié)構(gòu)致密，內(nèi)核有很多空洞結(jié)構(gòu)，該結(jié)果說明本實驗制作的凝膠球結(jié)構(gòu)能用于對紫薯花色苷的包埋。

3 結(jié)論

本實驗制備了海藻酸鈉與果膠的復(fù)合鈣凝膠球并用于對紫薯花色苷的包埋，運用單因素及正交實驗分析方法探討了果膠與海藻酸鈉比例、氯化鈣濃度、膠凝時間對海藻酸鈉-果膠鈣凝膠球的機械性能及對紫薯花色苷包埋率的影響。由單因素實驗結(jié)果可知，隨著果膠與海藻酸鈉比例的增大、氯化鈣濃度的增大，凝膠球的硬度增大，彈性則沒有顯著性差異，膠凝時間的延長使凝膠球的硬度增加，彈性顯著性降低，評價指標中硬度與包封率為強正相關(guān)。采用正交實驗進一步優(yōu)化果膠-海藻酸鈉凝膠球形成的條件，得出最優(yōu)組：果膠與海藻酸鈉比例為7∶1，氯化鈣濃度9%，膠凝時間5 min。此時凝膠球硬度最大、包封率最高1.10 mg/mL。將荷載紫薯花色苷的果膠-海藻酸鈉復(fù)合鈣凝膠球進行溶脹、體外緩釋、SEM實驗，結(jié)果表明凝膠球形成的殼核結(jié)構(gòu)能將紫薯花色苷包埋于其中，且能定向輸送至腸道進行人體的吸收，可有效避免胃液對紫薯花色苷的消化降解，提高了紫薯花色苷在人體中的生物利用率。