王思思，徐 楊，張啟煥，邢曉平，王資生，高 謙，齊志濤

（1.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212003；2.鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城 224051；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

Toll樣受體（Toll like receptor，TLRs）是機體重要的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs），能夠識別多種病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMPs），并通過下游信號通路激活相關(guān)基因表達而清除病原微生物［1］。TLRs屬于I型跨膜蛋白家族，含有3個保守的結(jié)構(gòu)域，分別為胞外N端亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域（leucine rich repeat，LRR）、跨膜區(qū)、胞內(nèi)Toll／白細胞介素 1受體結(jié)構(gòu)域（Toll／interleukin 1 receptor，TIR）。LRR結(jié)構(gòu)域主要參與PAMPs識別，而TIR結(jié)構(gòu)域則參與下游信號通路激活［2］。

目前，在哺乳類動物中發(fā)現(xiàn)了13個TLRs（TLR1～TLR13）。在低等脊椎動物 魚類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20多個TLRs，包括TRL1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5M、TLR5S、TLR7 9、TLR13、TLR14、TLR18 28［3－4］。根據(jù)系統(tǒng)進化樹分析可以將脊椎動物的TLRs劃分為6個亞家族，分別是TLR1、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR11亞家族。哺乳類TLR1亞家族成員包括TLR1、TLR2、TLR6和TLR10，而魚類TLR1亞家族包括TLR1、TLR2、TLR18、TLR25、TLR28［5］。

TLR18作為TLR1亞家族成員，目前已經(jīng)在斑馬魚（Daniorerio）［6］、斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［7］、大西 洋鮭（Salmosalar）［8］、草 魚（Ctenopharyngodonidella）［9］、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）［10］和鯉（Cyprinuscarpio）［11］等研究中得到報道。然而，在鯔科魚類中尚未見TLR18相關(guān)報道。

梭魚（Lizahaematocheila）為鯔科魚類代表種之一，已經(jīng)成為我國沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類［12］。隨著梭魚養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，養(yǎng)殖病害也逐年增多，尤其是細菌性疾病已經(jīng)成為限制梭魚養(yǎng)殖的重要因素。停乳鏈球菌（Streptococcusdysgalactiae）為革蘭氏陽性細菌，是多種魚類的致病菌。前期研究發(fā)現(xiàn)梭魚腹腔注射停乳鏈球菌后7 d死亡率達到80%以上［13］。然而，目前對梭魚感染停乳鏈球菌后免疫反應(yīng)的研究非常欠缺，極大地限制了采用免疫學(xué)方法（如細菌性疫苗）預(yù)防梭魚細菌性疾病的技術(shù)發(fā)展。本文對梭魚TLR18進行了基因克隆并采用熒光定量PCR對其在正常組織和細菌感染后組織中的表達模式進行了研究，以期為深入探討梭魚乃至整個鯔科魚類TLRs的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 梭魚及細菌感染

健康梭魚［平均體質(zhì)量（8±2）g］購自江蘇鹽城當?shù)仞B(yǎng)魚場。在本實驗室的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)一周［水溫：（28±2）℃；光照周期：12D／12L，飼喂：2次·d－1］之后，采用MS 222處理，解剖5尾魚，各取8個不同組織（鰓、皮膚、肌肉、肝、脾、頭腎、腸、腦）。

停乳鏈球菌由中國科學(xué)院水生生物研究所李愛華研究員提供［14］，在本實驗室培養(yǎng)后離心收集并計數(shù)，用PBS調(diào)整細菌濃度備用。20尾梭魚隨機平均分為試驗組和對照組，試驗組腹腔注射4×105cfu停乳鏈球菌（100μL）［15］，對照組注射等量PBS。在注射12 h和24 h后，分別從對照組和試驗組隨機解剖5尾魚，各取8個不同組織（鰓、皮膚、肌肉、肝、脾、頭腎、腸、腦）。采集的組織樣品立即在液氮中冷凍，然后在－80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取與cDNA合成

采用Trizol試劑盒提取各個組織總RNA（Invitrogen，USA）。采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，USA）合成SMART cDNA。采用Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）合成cDNA第一鏈。

1.3 梭魚TLR18全長序列的擴增

梭魚TLR18部分cDNA序列來自梭魚脾臟轉(zhuǎn)錄組［12］。根據(jù)梭魚TLR18部分序列設(shè)計特異性引物進行序列驗證后，采用RACE PCR方法獲得梭魚TLR18cDNA全長。所用引物序列見表1。

1.4 序列分析

采用ExPASy網(wǎng)站中的Translate軟件對梭魚TLR18氨基酸序列進行推導(dǎo)［16］。采用SMART（simplemodular architecture research tool）軟件對TLR18的跨膜區(qū)、LRR結(jié)構(gòu)域、TIR結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測［17］。采用ExPASy網(wǎng)站中的pI／Mw工具對梭魚TLR18蛋白質(zhì)分子量和等電點進行預(yù)測。序列相似性采用DNAStar軟件包中的MegAlign進行計算。采用MEGA 6.0軟件中的鄰接法（neighbor joining，N J）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，所用的模 型 為Jones Taylor Thornton（JTT）模 型，bootstrap設(shè)置為10 000［18］。

1.5 梭魚TLR18的表達分析

分別根據(jù)梭魚TLR18和βactin（內(nèi)參基因）［15］cDNA序列采用Primer premier6.0軟件設(shè)計熒光定量PCR引物（表1）。qPCR反應(yīng)體系：SYBR Premix 5μL，上 下 游 引 物（濃 度 為10 μmol·L－1）各0.5μL，模板3μL，ddH2O 1μL。反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性30 s，一步法擴增40個循環(huán)，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，循環(huán)結(jié)束后，繪制熔解曲線。每個組織樣品重復(fù)3次。采用2－ΔΔCT方法分析TLR18在正常組織和細菌感染后組織表達情況［19］。利用SPSS 18.0軟件中單因素方差分析進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析（顯著性水平設(shè)為P＜0.05），利用Graphpad進行多重比較和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 梭魚TLR18基因序列分析

梭魚TLR18cDNA全長為2 753 bp（GenBank登錄號：MT254067），其中5′非編碼區(qū)長34 bp，3′非編碼區(qū)長97 bp，開放閱讀框全長2 622 bp，編碼873個氨基酸（aa）。p I／Mw軟件預(yù)測顯示梭魚TLR18的理論分子量為100.59 kD，理論等電點為8.47。SignalP 3.0軟件預(yù)測顯示梭魚TLR18含有一個長度為17個氨基酸的信號肽序列。SMART軟件預(yù)測顯示梭魚含有6個LRR、1個LRR CT、1個跨膜區(qū)和1個TIR結(jié)構(gòu)域（圖1，圖2）。在LRR CT結(jié)構(gòu)域中含有4個保守的半胱氨酸。TIR結(jié)構(gòu)域含有2個保守的基序，分別是LC RD （A／P）G和FWXRLR。梭魚TLR18與其他魚類TLR18具有較高的序列相似性（57.4%～68.8%），其中與大西洋鮭TLR18序列相似性最高（68.8%）（表2）。

圖1 梭魚TLR18 cDNA及其氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and putative am ino acid sequences of Liza haematocheila TLR18

表2 梭魚TLR18與其他魚類TLR18序列相似性分析Tab.2 Com parison of TLR18 sequence identity between Liza haematocheila and other teleosts

2.2 系統(tǒng)進化樹分析

采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹（圖3），結(jié)果顯示魚類TLR18聚為一枝，該枝進一步分為兩個小的進化枝，其中一枝包含草魚TLR18、團頭魴（Megalobramaamblycephala）TLR18、鯉TLR18、斑馬魚TLR18和斑點叉尾鮰TLR18，另外一枝包括梭魚TLR18和大西洋鮭TLR18。

2.3 梭魚TLR18在正常組織中表達分析

采用熒光定量PCR方法檢測了TLR18在健康梭魚8個組織（鰓、皮膚、肌肉、肝、脾、頭腎、腸、腦）中的表達情況，結(jié)果顯示梭魚TLR18呈組成型表達，在所選擇的8個組織中均有表達，其中在頭腎、脾臟和肝臟中表達量較高，而在鰓和腸中表達量較低（圖4）。

2.4 梭魚TLR18在細菌感染后不同組織的表達分析

采用熒光定量PCR方法檢測了TLR18在停乳鏈球菌感染12 h和24 h后表達變化情況。結(jié)果顯示，在停乳鏈球菌感染12 h后，梭魚TLR18在除鰓以外的其他組織中均呈顯著下調(diào)表達（P＜0.05）；在停乳鏈球菌感染24 h，梭魚TLR18在除脾臟以外的組織中呈顯著上調(diào)表達（P＜0.05）（圖5）。

圖2 部分魚類TLR18結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Protein domain analysis of fish TLR18

圖3 魚類TLR18系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of fish TLR18

圖4 梭魚TLR18在正常組織中的表達Fig.4 Expression analysis of TLR18 in normal tissues of Liza haematocheila

圖5 梭魚TLR18在停乳鏈球菌感染后表達變化Fig.5 Expression of TLR18 in tissues of Liza haematocheila follow ing Streptococcus dysgalactiae infection

3 討論

TLR18是TLR1亞家族成員，目前僅在少數(shù)魚類中得到克隆和鑒定。本文首次對鯔科魚類代表種 梭魚的TLR18進行了克隆和表達分析。梭魚TLR18編碼873個氨基酸，與其他魚類TLR18具有相似長度的氨基酸序列（852 aa～898 aa）（圖2）。同時，梭魚TLR18與其他魚類TLR18具有較高的序列相似性（表2），且系統(tǒng)進化樹分析顯示其與其他魚類TLR18聚為一枝（枝值達到了100%）（圖3）。SMART分析顯示梭魚TLR18含有TLRs家族典型結(jié)構(gòu)域，包括6個LRRs、1個LRR CT、1個跨膜區(qū)和1個TIR結(jié)構(gòu)域（圖1～圖2）。LRRs結(jié)構(gòu)域的序列和數(shù)量決定了TLRs對不同PAMPs的識別特性［20］。梭魚TLR18與其他魚類TLR18具有類似的LRRs結(jié)構(gòu)域數(shù)量，如斑馬魚和大西洋鮭的TLR18均含有6個LRRs和1個LRR CT結(jié)構(gòu)域（圖2），提示梭魚TLR18與其他魚類TLR18具有相似的功能。與其他魚類TLR18相一致，梭魚TLR18也含有一個跨膜區(qū)，提示梭魚TLR18可能在細胞膜上發(fā)揮功能。梭魚TLR18的LRR CT結(jié)構(gòu)域中含有4個保守的半胱氨酸，發(fā)揮穩(wěn)定TLR18結(jié)構(gòu)的作用。TIR結(jié)構(gòu)域參與TLRs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［21］。在梭魚TLR18的TIR結(jié)構(gòu)域中含有LC RD （A／P）G和FWXRLR兩個保守基序，其中LC RD （A／P）G基序主要參與TLRs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而FWXRLR基序則參與TLRs的細胞定位功能［21］。

梭魚TLR18呈組成型表達，在健康梭魚的不同組織中均有表達，這與其他魚類TLR18的表達模式一致［7－11］。但是，不同魚類TLR18在不同的組織中表達水平不盡相同。斑點叉尾鮰TLR18在鰓和后腎中表達較高［7］；大西洋鮭TLR18在肌肉和肝臟中高表達［8］；草魚TLR18在脾臟、鰓和心 臟 中 高 表 達［9］。黃 顙 魚（Pelteobagrus fulvidraco）TLR18在脾臟和頭腎中高表達［10］；鯉TLR18則在皮膚和脾臟中高表達［11］；梭魚TLR18在頭腎、脾臟和肝臟中高表達（圖4）。這些研究表明魚類TLR18在正常組織中的表達具有種屬特異性和組織特異性。

在病原微生物感染或PAMPs刺激后，不同魚類的TLR18表達變化不盡相同。斑馬魚TLR18在分支桿菌Mycobacterium marinum感染后呈顯著上調(diào)表達［6］。大西洋鮭TLR18在鮭魚傳染性貧血病毒（infectious salmon anaemia virus，ISAV）感染后無顯著表達變化［8］。草魚TLR18在滅活嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）感染后在頭腎、皮膚、腸中顯著上調(diào)表達，在脾臟中呈顯著下調(diào)表達，而在肝臟中無明顯變化［9］。黃顙魚TLR18在嗜水氣單胞菌感染后6 h在脾臟中呈下調(diào)表達，48 h～72 h在脾臟中呈上調(diào)表達，6 h～48 h在頭腎中呈上調(diào)表達［10］。本文發(fā)現(xiàn)梭魚TLR18在停乳鏈球菌感染后12 h在肌肉、頭腎、肝臟、脾臟和腸中呈顯著下調(diào)表達；24 h則在鰓、肌肉、頭腎、腸和肝臟中呈顯著上調(diào)表達（圖5）。上述研究提示TLR18可能參與了魚類針對細菌的免疫反應(yīng)。

綜上所述，本文克隆獲得了梭魚TLR18基因cDNA序列全長，其蛋白結(jié)構(gòu)含有典型的TLRs家族結(jié)構(gòu)域。梭魚TLR18在正常組織中呈組成型表達，并在停乳鏈球菌感染后呈顯著誘導(dǎo)表達，表明TLR18基因在梭魚細菌免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，其具體識別機制和抗菌機制有待進一步研究。